原位杂交技术电话「在线咨询」
作者:思特进2021/11/13 3:04:05






就DNA探针和RNA探针的比较,DNA探针在杂交过程中会出现探针双链之间退火的可能,也更倾向于在溶液中形成大分子的探针聚合体,从而影响其渗透能力。而RNA 探针的应用,将提高DNA-RNA杂交子的热稳定性。

Tips:RNA探针因其单链、高分子结合力、可适应高温杂交的特性,其检测特异性和灵敏度均优于DNA探针。常用的RNA探针标记方法为构建质粒后进行转率合成。通过PCR扩增的方法,可以更方便地进行RNA探针的制备;RNA探针合成后,还需验证其对目标片段检测的灵敏度和特异性。





惰性多聚体可用来促进250个碱基以上的探针的杂交率。对单链探针可增加3倍,而对双链探针、随机剪切或随机引物标记的探针可增加高达100倍。而短探针不需用促进剂,因其复杂度低和分子量小 ,短探针本身的杂交率就高 。***葡聚糖是一种广泛用于较长双链探针杂交的促进剂。这是一种多聚胺,平均分子量为500 000。另一种常见的促进剂是聚乙二醇(PEG),PEG分子量小(6000~8000)、粘度低、价格低廉,但它不能完成取代***葡聚糖。在某些条件下5%~10%***葡聚糖效果较好,若用5%~10%PEG则可产生很高的本底。因此,使用促进剂时有必要优化条件。



总的来说,随探针浓度增加,杂交率也增加。另外,在较窄的范围内,随探针浓度增加,敏***增加。依我们的经验,要获得较满意的敏***,膜杂交中32P标记探针与非放0射性标记探针的用量分别为5~10 ng/ml和25~1000ng/ml,而原位杂交中,无论应用何种标记探针,其用量均为0.5~5.0μg/ml。探针的任何内在物理特性均不影响其使用浓度,但受不同类型标记物的固相支持物的非特异结合特性的影响。



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