甲l基化特异性的PCR

Herman 等（ 1996 ）在使用重亚***盐处理的基础上新建的一种方法。该方法敏***高，主要用于作定性研究。用亚***氢盐处理***组DNA，所有未发生jia基化的胞嘧定被转化为尿嘧ding，而jia基化的胞嘧定不变；随后设计针对jia基化和非jia基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后jia基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在jia基化；ELISA的基础是抗原或抗ti的固相化及抗原或抗ti的酶标记。反之，说明被检测的位点不存在jia基化。

特点：适用范围广，能够检测特异位点是否发生jia基化。

亚***氢盐测序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）

亚***氢盐修饰后测序法（ BSP ） Frommer 等（ 1992 ）提出的研究 DNA jia基化方法，此方法可靠性及jing确度高，能明确目的片段中每一个 CpG 位点的jia基化状态。用亚***氢盐处理***组DNA，所有未发生jia基化的胞嘧ding被转化为尿嘧ding，而jia基化的胞嘧ding不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧定全部转化为胸腺嘧定，***后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生jia基化，称为BSP-直接测序法。将PCR产物克long至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-ke隆测序法。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次。

特点：jing确度高，能够准确检测出jia基化的程度百分比。

二、大肠菌群检验方法:

由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的***，即:需氧及兼性厌氧、在37°C能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞。因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行。 目前国内采用的进出口食品大肠菌群检测方法主要有和原***商检局制订的行业标准。两个标准方法在检测程序上略有不同。转录组研究是***功能及***结构等研究的基础，通过新一代高通量测序，能够快速的获得某一物种特定***或在某一状态下的几乎所有转录本序列信息，已广泛应用于临床诊断、基础研究和研发等领域。

(一):采用三步法，即:乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。乳糖发酵试验:样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。36士1C培养48土2h，观察是否产气。分离培养:将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36士1°C培养18-24h，观察菌落形态。证实试验:挑取平板上的菌落，进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管36士1°C培养24土2h,观察产气情况。CmRNA相对表达量变化从图中可以扩增曲线可以看出目的RNA扩增效果，溶解曲线可以看出引物识别特异性情况，通过使用ΔΔCt方法计算可以得到每个组中目的mRNA表达变化。

报告:

根据证实为大肠阳性的管数，查MPN表，报告每100ml ( g)大肠菌群的MPN值。具体操作参见GB4789. 3-94 《中华人民共和***品卫生微生物学检验大肠菌群测定》

(二)原***商检局制订的行业标准，等效采用美国FDA的标准方法，用于对出口食品中的大肠进行检测。本方法采用两步法：推测试验:样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管LST肉汤。36士1C培养48士2h，观察是否产气。证实试验:将产气管培养物接种煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤管中，36士1°C培养48士2h，观察是否产气。以BGLB产气为阳性。查MPN表，报告每ml(g)样品中大肠菌群的MPN值。用预先固化在beads上的蛋白质A的抗ti免yi沉淀A蛋白，那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来，再通过蛋白变性分离，对B蛋白进行检测，进而证明两者间的相互作用。具体操作参见SN0169-92《中华人民共和国进出口商品检验行业标准 出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠检验方法》

蛋白质双向电泳实验流程

1.三氯yi酸-bing酮沉淀法提取蛋白

2.双向电泳分离待测样品

(1)一相等电聚焦前处理按照所用仪器的厂商提供操作手册进行。蛋白质上样浓度不要超过10mg/mL,否则会造成蛋白质的聚集或沉淀。

(2)等电聚焦完毕后(约需24hr），若不立即进行第二相电泳，胶条可夹在两层塑料薄膜中于-70℃保存数月。

(3)等电聚焦好的胶条按厂商提供的操作手册平衡两次。平衡完毕后，于电泳仪上用12.5%SDS-PAGE凝胶进行电泳分离。仪器设置为2.5W/胶 45min，15W/胶 5-8hr，20℃。

3.银染法对凝胶进行染色

(1)固定(2)清洗(3)增敏(4)清洗(5)染色(6)清洗(7)显影(8)定影(9)水洗

3.凝胶扫描及图像分析

(1)图像扫描：凝胶染色后采用Image scanner以300dpi，16-bit模式（65536灰阶）进行扫描。

(2)图像分析：扫描完毕后，凝胶继续置于1%yi酸中于4℃保存。扫描后的图像用ImageMaster 2D Platinum software软件进行分析。分析按照软件厂商提供的说明书进行。以***小点面积30，平滑度2为主要参数***大限度检测蛋白质点。以目标蛋白质3个重复具有相同趋势，目标蛋白质相邻位点的相对一致性，至少2个重复有2倍以上差异作为判定差异表达蛋白质的标准。结合在固相载体表面的抗原或抗ti仍保持其免yi学活性，酶标记的抗原或抗ti既保留其免yi学活性，又保留酶的活性。

活性氧检测***盒（Reactive oxygen species assay kit）是一种利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的***盒。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。 本***盒提供了活性氧阳性对照***Rosup以便于活性氧的检测。Rosup是一种混合物（compound mixture），浓度为50mg/ml。miRNA在物种进化中相当保守，在动物、植物和***等中发现的miRNA表达均有严格的***特异性和时序性。

一、注意事项

1、探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。

2、探针装载完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的装载情况是否良好。

3、尽量缩短探针装载后到测定所用的时间（刺激时间除外），以减少各种可能的误差。

4、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。