ELISA 是一种结合抗原、抗ti特异性反应和酶对底物高xiao催化作用的高敏***免yi学实验技术。ELISA 的基础是抗原或抗ti的固相化及抗原或抗ti的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗ti仍保持其免yi学活性，酶标记的抗原或抗ti既保留其免yi学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本(测定其中的抗ti或抗原)与固相载体表面的抗原或抗ti起反应，洗涤使固相载体上形成的抗原抗ti复合物与液体中的其他物质分开，再加入酶标记的抗原或抗ti，通过反应使其结合在固相载体上。-般:在93°C预变性3-5min,进入循环扩增阶段:93°***0s→58°C30s→72°C60s,循环30-35次，后在72°C保温7min。此时固相上的酶含量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。

蛋白质的分离纯化在生***学研究应用中使用广泛，是一项重要的操作技术。 一个典型的真核细胞可以包含数以千计的不同蛋白质，一些含量十分丰富，一些仅含有几个拷贝。为了研究某一个蛋白质，必须首先将该蛋白质从其他蛋白质和非蛋白质分子中纯化出来。

一、主要方法

1. 蛋白质的选择吸附分离（利用颗粒不同程度的颗粒吸附力来使分离的目的达到）。

2. 按照配体特性的分离-亲和层析（利用蛋白质分子与另一种称为配体的分子能够特异结合这一生物性质）。

3. 低温沉淀法，使用如，乙醇等与水可混溶的，降低多数蛋白质的溶解度并且将其析出，和盐析相比较，这种方法的分辨率更加的高，然而蛋白质比较容易变形，需要在低温下进行。

4. 按照分子大小不一样的方法，密度梯度离心（在介质中对蛋白质离心时，蛋白质沉降速度取决于它的质量和密度，质量和密度越大，那么沉降越快；凝胶过滤（一种柱层析）；超过滤（利用蛋白质分子不能从半透膜通过的性质）。

5. 按照溶解度差异分离，等电点沉淀法盐溶与盐析（使用一定浓度盐溶液来使蛋白质的溶解度增大或减小）；（因为在等电点时蛋白质分子的净电荷为 0，使分子间静电斥力减少了，所以，聚集沉淀比较容易，这时具有小的溶解度）。

6. 按照电荷不同的分离方法。主要分为离子交换层析和电泳分离。

20.Primer设计的基本原则是什么？

答：引物设计的下列原则供您参考。

◆引物长度一般在18-35mer。

◆G-C含量控制在40-60%左右。

◆避免近3'端有酶切位点或发夹结构。

◆如果可能避免在3'端5个碱基有2个以上的G或C。

◆如果可能避免在3'端1个碱基为A。

◆避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。

◆退火温度Tm控制在 58-60C 左右。

◆如果是设计点突变引物，突变点应尽可能在引物的中间。

21.为什么引物的OD260/OD280小于1.5 ？

答：引物应该全是DNA，但是OD260/OD280的比值为什么那么低，怎么会有蛋白质污染？2、细胞转染:取两个EP管，一个加入Opti-MEM、核心质粒和包装质粒。引***学合成，哪里有机会污染到蛋白质？需要指出的是OD260/OD280的比值不能用来衡量引物的纯度。OD260/OD280的比值过低一般是由于引物中C/T 的含量比较高所致。下表是一个20mer 同聚体引物的OD260/OD280的比值，清楚表明OD260/OD280的比值与引物的碱基组成密切相关。