Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的检测***。WST-8【化学名：2-(2-甲氧ji-4-硝ji苯ji)-3-(4-硝ji苯ji)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，是一种类似于MTT的化合物，它在电子载体1-甲氧ji-5-甲ji吩嗪鎓***二jia酯（1-Methoxy PMS）存在的情况下，被线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙***甲瓒产物（formazan）。细胞增殖越多越快，颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅，对于同样的细胞，颜色的深浅与活xi胞的数量成正比，因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。

细胞培养中常见的污染及解决方法

霉菌污染

正常情况下，培养基在 37℃ 培养箱中培养两三天，在倒置显微镜下仍保持透明，无杂质。一旦出现絮状杂质，显微镜下可见丝状和团块状漂浮物，菌丝明显。此时，虽然细胞仍在生长，但它们的生命状态会在长时间后逐渐恶化。

解决方法：用***铜溶液擦拭 CO2 培养箱，向托盘中加入饱和***铜或消毒后加入饱和磷酸氢二钠高盐溶液，避免霉菌污染。

如果霉菌污染，暂时转移所有细胞，并立即使用 guo 氧擦拭培养箱，包括层板和内壁。将 guo 氧放在培养箱中一小时，使蒸汽扩散，待 guo 氧气味消散后，将细胞转移到培养箱中。值得注意的是，培养箱需要每两个月定期清洗一次，尤其是在梅雨季节。与传统的2D贴壁细胞培养模型相比，3D多细胞肿liu球可以通过模拟三维细胞网络、细胞与基质、细胞与细胞之间的相互作用，从而更加贴近肿liu***中相应的病理生理特征。用 84 消毒液、清水和 75% 酒精连续擦拭培养箱，用紫外线照射也是一种有效的方法。

为防止霉菌污染，需添加 3μg/ml 、***素、fang

线菌素 D 或青链。一旦被污染，就不可能***，即使使用上述，也没有什么区别。对于支原体污染的细胞培养，选择是丢弃污染的培养物，并用使用新鲜的无支原体的储存液，消毒环境。如果所有的细胞都被污染了，那可能是整个培养系统污染了。因此，必须对培养基和实验设备进行检查。几乎针对任何种系任何细胞的任何一种单抗或多抗,均可用于间接标记。如果只是个别污染，可能是操作问题，有必要注意实验操作步骤的规范。

细胞转染实验

目的

学习和掌握外源***导入真核细胞的主要方法——脂质体介导的转染。了解外源***进入的一般性方法，观测外源蛋白的表达（绿色荧光蛋白），为染色准备实验材料。

实验原理

上图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外源质粒进入细胞的一般过程。

外源***进入细胞主要有四种方法：法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源***进入细胞；病毒法是利用包装了外源***的病毒细胞的方法使得其进入细胞。但是由于法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大；观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细zhen孔空隙时终止消化。病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响；所以现在对于很多普通细胞系，一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。

利用脂质体转染法重要的就是防止其毒性，因此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。

关于细胞冻存的注意事项：

1.  为保持细胞大存活率，一般都采用慢冻存融的方法。

2.  冻存物距液氮面越近温度越低。标准的低冻速度为－1℃~12℃/ 分钟，当温度下降达－25℃时，下降速度可增至－5~－10℃/ 分钟，到－100℃时则可迅速冻入液氮中。因此要适当掌握冻存物下降入液氮中的速度，过快能影响细胞内水分透出，太慢则促冰晶形成。细胞诱导是指将一群不同类型或者形态结构、功能特征存在差异的细胞通过生物学、物理学等手段，将之转变为具有相似/相同形态结构、功能特征的细胞群体的过程。

3.  初次冻存者在下降冻存时，宜先用细木棒伸入罐中探测液面位置，然后需用温度计与冻存物并行的办法，以观测下降冻存物的速度、冻存物与液氮液面距离和温度三者关系，当已掌握以上各参数和冻存技术熟练后，仅按下降时间和下降距离便可获理想冻存效果。