自噬流检测

自噬是调节真核细鹏生长、和能量代谢的重要生物学机制。细胞自噬行使其生物学功能的前提是自噬流的话化。大量证据表明自噬流受损与多种慢性炎性***，特别是、***退行性***及***纤维化的发病密切相关，目前对于自噬液的检别是自噬与其相关***研究领域的热点。由于自噬流是一个曲多个步骤组成的动态过程。接种细胞的密度每平方厘米不超过35个，一般6cm的平皿接种1000个细胞。因此往需要精细的突验才能准确判断自啦流状态。

三、自噬过程进行观察和检测

1、观察自噬体的形成

由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。Phagophore的特征为:新月状或杯状，双层或多层膜,有包绕胞浆成分的趋势。自噬体(***1 )的特征为:双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。(7)24小时后弃去培养液(看细胞贴壁情况)，PBS冲洗2-3次去除末贴壁细胞，加入培养液继续培养。自噬溶酶体(***2 )的特征为:单层膜，胞浆成分己降解。( autophagic vacuolo *** )

2、在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋 白来示踪自噬形成由于电镜耗时长，不利于监测(Monitoring) 自噬形成，人们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了此技术。无自噬时，GFP-LC3融合蛋 白弥散在胞浆中;自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转 位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。(4)再次用PBS缓冲液冲洗3次，滤干，将细小的软gu块置入放有0。

3、利用Western Blot检测LC3-II/比值的变化以评价自噬形成自噬形成时，胞浆型LC3 (即 LC3-I)会酶解掉一小段多肽，转变为(自噬体)膜型(即LC3-ID，因此，LC3-II/比值 的大小可估计自噬水平的高低。(注意: LC3对LC3-II有更高的亲和力，会造成假阳性。溶解，比色：加入MTT检测***，按操作要求孵育相应时间，在mei标仪内检测对照组和实验组的吸光值。方法2和3需结合使用，同时需考虑溶酶体活性的影响。)

4、MDC (Monodansylcad***erine ，单丹磺酰尸胺)染色:包括自噬体，所有酸性液泡都被染色，故属于非特异性的。

5、CellTrackerTM Green染色:主要用于双染色，但其能染所有的液泡，故也属于非特异性的。

细胞冻存有哪些注意事项？

细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。从而使得研发或生产者不必以杂交瘤细胞为载体保留该，而可以以碱基序列的形式进行保存和传播交流、鉴定。细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久;细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是的。

细胞冻存的步骤：

配制含 10%DMSO 或甘油、10~20% 小牛的冻存培养液;

取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用 PBS 清洗。

去除 PBS，加入适量胰蛋白酶 (覆盖培养皿表面) 把单层生长的细胞消化下来;

离心 1000rpm，5min;

去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的终密度为 5×106/ml~1×107/ml;

将细胞分装入冻存管中，每管 1~1.5 ml;

在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者;

冻存:标准的冻存程序为降温速率-1~-2℃/ min;当温度达-25℃以下时，可增至-5℃~-10℃/min;到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱 2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。细胞生物学服务南京英瀚斯生物科技公司自建有标准的细胞培养房，配备有生物安全柜、超净工作台、细胞三气培养箱、二氧化碳细胞培养箱、荧光倒置显微镜、体视镜、、流式细胞仪等设备。