细胞实验介绍——慢病毒建立稳转细胞系

慢病毒包装：公司使用3质粒慢病毒包装系统，慢病毒系统使用pLKO.1-EGFP、psPAX2、pMD2.G，过表达慢病毒系统使用pLVX-AcGFP、psPAX2、pMD2.G三质粒系统，将质粒混匀后使用磷酸钙转染方法转染至HEK293T细胞中，培养48h后，收集上清。使用genecopo公司慢病毒颗粒纯化***盒将慢病毒纯化。CD117(c-kit)阳性细胞和二者都阳性细胞所占百分比前后比较差异无显著性(P>。纯化后留取部分检测病毒滴度，其余病毒冻存于-80℃冰箱中。

滴度检测：将病毒颗粒使用梯度稀释，分别293T细胞，72h后，在荧光显微镜下观察细胞荧光表达情况。根据细胞荧光量计算病毒滴度。

细胞：在病毒前一天对细胞进行计数，接种约10000个细胞于12孔板中，培养过夜后使用无培养基稀释病毒，加入12孔板中对细胞进行，病毒数量根据推荐细胞的MOI加入（若无推荐MOI，需做病毒梯度：1,5,10,50,100 5个梯度对细胞），6h后去除含病毒溶液，加入完全培养基细胞培养，培养48h后，在荧光显微镜下观察细胞荧光强度。同时加入puromycin对细胞筛选，筛选约2周时间。原代细胞培养:(1)shen脏原位灌洗:SD大鼠用25%乌拉坦腹整***麻***后仰卧固定。细胞筛选好后，使用定量PCR和Western blot检测目的***的稳定表达情况。

实验流程：慢病毒质粒构建-HEK293T细胞培养-质粒转染293T细胞-病毒收集-病毒纯化-病毒滴度检测-细胞-稳转细胞筛选-稳转细胞鉴定

结果示例：

                                               图 A 病毒滴度检测；B 目的细胞病毒效果图

透射电镜自噬小体检测

胰酶消化，收集作用后的细胞，离心，先将细胞块固定在2.5%成二醛和0.1%的PBS溶液中保存在4C中过夜。

再用乙醇梯度脱水，接下来用环氧树脂浸透并切成薄片。随后超薄切片用铜网固定，后用***醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色。通过TEM分析凋亡细胞内超微结构变化，拍照保存。

贴壁细胞:先倒出培养液，采用胰蛋白酶消化或者用细胞刮(会产生碎屑)刮下:带培养液进行离心，100-1500/mim 5 10min。离心完毕倒出培养液。Phagophore的特征为:新月状或杯状，双层或多层膜,有包绕胞浆成分的趋势。管底的细胞团不要打散， 沿管壁倒入适量(一般为材料体积的5-10倍)的2.5-3.5%成醒固定液，固定约1h-2h. 也可在4C冰箱过夜。

软gu细胞培养

(1)豚鼠脱颈处死，备皮，用75%酒精消毒背部及四肢皮肤。

(2)无菌操作下取下双侧股骨头及膝关节(保留周围肌肉，软gu不能暴露)，75%酒精浸泡5分钟，转移至PBS缓冲液中，带入超净工作台，剔除关节周围附着的软***，打开髋、膝关节，用尖刀削取关节软gu***，置入装有PBS缓冲液的无菌培养皿，防止软gu***被风干。yao物对细胞的IC50检测IC50(halfmaximalinhibitoryconcentration)是指被测量的拮抗剂的半***浓度。

(3)PBS缓冲液充分漂洗软gu小块3次，然后用小剪刀将软gu块切碎至约Imm3大小。

(4)再次用PBS缓冲液冲洗3次，滤干，将细小的软gu块置入放有0.2%的II型胶原酶3ml的广口瓶里，摇匀后置于37°C恒温震荡箱中消化，40分钟后将上层消化液转移至15ml规格离心管中，800r/min离心5min,收集细胞(沉淀物),加入含10%的胎牛xue清DMEM培养液4ml并吹打混匀，制成软gu细胞混悬液。细胞培养：然后在无菌恒温细胞培养箱内培养接种好的96孔细胞培养板，并实时观察细胞状态。

(5)把消化所得的软gu细胞混悬液收集于离心管中，经滤网过滤后用细胞计数板计数,并把细胞混悬液密度调整为2x105/ml接种于25cm2规格的培养瓶中。将培养瓶放置于CO2培养箱内。培养条件为37°C、5%CO2。

(6)未消化完的软gu小块继续用II型胶原酶如_上法消化，直至软gu块基本消失。

(7)每日在倒置显微镜下观察软gu细胞生长情况并拍照保存。

细胞分化

细胞分化是指同一来源的细胞逐渐产生出形态结构、功能特征各不相同的细胞类群的过程，其结果是在空间上细胞产生差异，在时间上同一细胞与其从前的状态有所不同。细胞分化的本质是***组在时间和空间上的选择性表达，通过不同***表达的开启或关闭，终产生标志性蛋白质。去除髓质后将皮质剪成约1-2mm'的碎块，轻碾shen皮质依次通过80。细胞诱导是指将一群不同类型或者形态结构、功能特征存在差异的细胞通过生物学、物理学等手段，将之转变为具有相似/相同形态结构、功能特征的细胞群体的过程。