单核苷酸多态性( SNP )实验

SNP (Single Nucleotide Polymorphisn即单核苷酸多态性 ,是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态性(Polymorphi***)。据估计,在人类***组中,大约每千个碱基中有一个SNP ,无论是比较于度多态性(RFLP)分析还是微标记(STR) ,都要广泛得多。逆转录病毒载体主要优点：转染范围广，可以各种细胞类型，转入的外源***可完全融合，对细胞率高，细胞不产生病变，可建立细胞系长期持续表达外源***。

实验方法原理:

SNP (Single Nucleotide Polymorphisn即单核苷酸多态性,是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态性(Polymorphi***)。据估计,在人类***组中,大约每千个碱基中有一个SNP ,无论是比较于限制性段长度多态性(RFLP)分析还是微标记(STR) ,都要广泛得多。SNP是我们考察遗传变异的单位,据估计,人类的所有群体中大约存在一千万个SNP位点。-般认为,相邻的SNPs倾向于一起遗传给后代。PCR的电泳检测:如在反应管中加有石蜡油,需用100ul进行抽提反应混合液,以除去石蜡油。 于是,我们把位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点称作单体型( haplotype b大多数染色体区域只有少数几个常见的单体型(每个具有至少5%的频率),它们代表了一个群体中人与人之间的大部分多态性。-个染色体区域可以有很多SNP位点,但是我们一-旦掌握了这个区域的单体型,就可以只使用少数几个标签SNPs(tagSNP)来进行***分型,获取大部分的遗传多态模式。

DNA测序检测

1. PCR测序反应

(1)取0.2ml的PCR管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，按下表加***:

所加***测定模板管标准对照管

BigDye Mix

1μl

待测的质粒DNA

1μ 1

pGEM-3Zf (+)双链DNA

-1μ1

待测DNA的正向引物

M13(-21)引物- 1μ 1

灭菌去离子水

2μ 1

总反应体积5μ 1,不加轻矿物油或石蜡油，盖紧PCR管，用手指弹管混匀，稍离心。

(2)将PCR管置于9600或2400型PCR仪.上进行扩增。98C变性2min后进行PCR循环，

PCR循环参数为96C 10s， 50C 5s， 60°***min， 25 个循环，扩增结束后设置4C保温。

2.乙醇法纯化PCR产物

(1) 将混合物离心，将扩增产物转移到1.5ml EP管中。

(2)加入25μ 1/乙醇混合液，充分振荡，置冰上10min以沉淀DNA。12 000r/min于

4C离心30 min,小心弃上清。

(3)加70%(V/V)的乙醇50μ 1 洗涤沉淀2次。12 000r/min 于4C离心5min,小心弃上清和

管壁的液珠，真空干燥沉淀10~ 15min。

3.电泳前测序PCR产物的处理。

(1)加入12μ 1的TSR于离心管中，剧烈振荡，让其充分溶解DNA沉淀，稍离心。

(2)将溶液转移至盖体分离的0.2ml PCR管中，稍离心。

(3)在PCR仪上进行热变性(95C 2min),冰中骤冷，待_上机。

4..上机操作按仪器操作说明书安装毛细管，进行毛细管位置的校正，人工手动灌胶和建立

运行的测序顺序文件。

5.仪器将自动进行序列分析，并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知，可通过

序列比较以星号标出差异碱基处，提高工作效率。

6.测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与***。

20.Primer设计的基本原则是什么？

答：引物设计的下列原则供您参考。

◆引物长度一般在18-35mer。

◆G-C含量控制在40-60%左右。

◆避免近3'端有酶切位点或发夹结构。

◆如果可能避免在3'端5个碱基有2个以上的G或C。

◆如果可能避免在3'端1个碱基为A。

◆避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。

◆退火温度Tm控制在 58-60C 左右。

◆如果是设计点突变引物，突变点应尽可能在引物的中间。

21.为什么引物的OD260/OD280小于1.5 ？

答：引物应该全是DNA，但是OD260/OD280的比值为什么那么低，怎么会有蛋白质污染？随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧定全部转化为胸腺嘧定，***后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生jia基化，称为BSP-直接测序法。引***学合成，哪里有机会污染到蛋白质？需要指出的是OD260/OD280的比值不能用来衡量引物的纯度。OD260/OD280的比值过低一般是由于引物中C/T 的含量比较高所致。下表是一个20mer 同聚体引物的OD260/OD280的比值，清楚表明OD260/OD280的比值与引物的碱基组成密切相关。