***盒组成材料和***

1. 羊抗小鼠IgG包被的96孔微孔板一张 catalog No.30101

该微孔板将特异性识别小鼠IgG 的山羊抗l体包被于可拆分酶标条上。

2. cAMP偶联的辣根过氧化物酶工作液6 mL catalog No. 30102

本包装含1000×偶联酶储存液和稀释缓冲液。

3. 抗cAMP的小鼠单克l隆抗l体工作液6 mL catalog No. 26002-2

本包装含1000×抗l体储存液和稀释缓冲液。

注意：为了稳定和长效的实验，抗l体储存于-80℃。在使用前将6μL 1000×偶联酶储存液加入到6 mL 稀释缓冲液中配制为工作液，并轻轻混匀。工作液请避免反复冻融。

4. 中和液6 mL catalog No. 30103

5. 10×浓缩洗涤液15 mL catalog No. 30103

含去污剂的磷酸盐缓冲液。

6. cAMP标准品0.25 mL catalog No. 30203

浓度5000 pmol/ mL

7. 显色底物A，12 mL catalog No. 30107

8. 显色底物B, 12 mL。 catalog No. 30108

9. 终止液，6 mL； catalog No. 30110

注意：该溶液有腐蚀性；储存时请旋紧瓶盖

***准备

1. 非乙酰化cAMP标准品

将5000 pmol/mL cAMP标准品溶液平衡至室温。从#1至#6标记六只洁净试管。移取475μL 0.1M HCl到#1号试管，400μL到#2至#6号试管。加入25μL 5000 pmol/mL cAMP标准品到#1管中，剧烈涡旋震荡。从#1管中取出100μL溶液至#2管中，涡旋震荡。以此类推，重复上步操作，梯度稀释至#6管。

经以上操作，#1至#6管中cAMP标准品浓度分别为250,50，10,2,0.4和0.08 pmol/mL（详见cAMP实验稀释详情键盘纸）。稀释过的标准品需在30分钟内使用。

标记一只试管作为无标准品空白对照（NSB）。移取600μL 0.1M HCl到NSB管中。

2. 洗涤液

将15 mL 10×洗涤液储液加到135 mL去离子水中，稀释成工作液。稀释液可在室温保存至***盒有效期限，或者3个月。

实验步骤

使用前将各种***取出放置30分钟，平衡至室温。所有标准品和样品必需设置平行对照实验。

快速加入***至样品中，立即漩涡震荡2秒混匀。

1. 依据实验键盘纸决定酶标条的使用量，将剩余的酶标条连同干燥剂一起放回密封塑料袋，密封，4℃保存。

2. 移取50μL中和液至各个微孔中，除了TA(全活性)孔和Blank(空白)孔。

3. 移取100μL 0.1M HCl至NSB(非特异结合)孔和B0孔(0 pmol/mL cAMP标准品)。

4. 移取100μL cAMP标准品至相应的孔。

5. 移取100μL样品至相应的孔。

6. 移取50μL 0.1M HCl至NSB(非特异结合)孔。7. 移取50μL 偶联酶至各孔中，除了TA(全活性)孔和Blank(空白)孔。

8. 移取50μL 抗l体工作液至各孔中，除了TA(全活性)孔、Blank(空白)孔和NSB(非特异结合)孔。

9. 将酶标孔置于孔板振动器上，250~500rpm，室温孵育2小时。

10. 在吸水纸上拍干微孔内溶液，加洗涤液400μL每孔洗3次，每次需拍干。

11. 后一次洗涤，清空各微孔，在干净的无尘吸水纸上轻巧酶标板数次，以确保没有洗涤液残留。

12. 加5μL 偶联酶至TA(全活性)孔。

13. 每孔200μL显色底物溶液，于室温静置5~30分钟。（显色底物A和B需在临用前15分钟内等体积混合，并避光放置。）

14. 每孔加入50μL终止液。终止后立即读数。

15. 清除酶标l仪Blank(空白)孔值，读取450nm处的光密度值，在570nm至590nm之间有修正。如果酶标l仪不能自动清除Blank(空白)孔值，那么手动扣除每个读数的Blank(空白)孔光密度值。

包被抗l体（或抗原）的选择：将抗l体（或抗原）吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃ 18～24小时。蛋白质包被的较适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度（0.1、1.0和10μg/ml等）进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值较大而蛋白量较少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg/ml。