测定步骤

I.主动Arf 6下拉分析

1.将0.5 – 1 mL细胞裂解液等分到微量离心管中。

2.使用1X分析/裂解缓冲液将每个样品的体积调整为1 mL。

3.在管中加入1 μl抗活性Arf 6单克l隆抗l体。

4.通过涡旋或滴定重悬蛋白A / G琼脂糖珠浆。

5.快速向每个管中添加20 μL重悬浮的珠浆。

6.轻轻搅拌将试管在4°C下孵育1小时。

7.通过以5,000 x g离心1分钟来沉淀小珠。

8.吸出并丢弃上清液，确保不要干扰/除去珠粒。

9.用0.5 mL的1X Assay / Lysis Buffer洗涤磁珠3次，每次离心并吸出。

10.后一次洗涤后，将珠粒沉淀并小心除去所有上清液。

11.将磁珠沉淀重悬于20 μL 2X还原SDS-PAGE样品缓冲液中。

12.将每个样品煮沸5分钟。

13.以5,000 x g的速度离心每个样品10秒钟。

当前没有直接测定法来测量Arl1 GTPases的激l活。

NewEast Biosciences Arl1激l活检测***盒基于特定于配置的单克l隆抗l体，该抗l体特异性识别Arl1-GTP，但不能识别Arl1-GDP。 鉴于单克l隆抗l体对其抗原的高度亲和力，可以在短时间内进行激l活测定。 该测定法可提供可靠的结果，并具有一致的可重复性。

***制备

1X Assay/Lysis Buffer：实验前用去离子水将5X的Assay/Lysis缓冲液稀释成1X的缓冲液，并在使用前加入蛋白酶***l剂如1 mM PMSF, 10 μg/mL leupeptin（亮肽素），或 10 μg/mL aprotinin（抑肽酶）。

样品处理

贴壁细胞

1. 培养细胞密度达到大约80%-90%之间（直径10 cm培养皿，~107个细胞），并用活性剂或***l剂进行处理。

2. 吸去培养基并用冰冷的PBS洗涤两次。

3. 向细胞中加入1X Assay/Lysis缓冲液（每个直径10cm的***培养皿中加入0.5-1mL）。

4. 将培养皿放置于冰上处理10-20分钟。

5. 用细胞刮棒把细胞从培养皿下分离下来。

6. 将细胞裂解物转入合适的管中并放置于冰上。

7. 如果核发生裂解，细胞裂解物可能会变得非常的粘稠并且难以吸取。当这种情况出现时，将细胞裂解物用27?的***l器针头来回吸取3-4次，以******组DNA，从而避免上述情况的出现。

8. 4°C 12000 g, 离心10 min。

9. 收集上清（~1-2 mg总蛋白）并放置于冰上使用。如果样品不立即使用，请将处理后的样品存放于-70°C条件下。

武汉纽斯特生物科技有限公司（WuhanNewEastBiotechonologyCo.Ltd），系美国生命科学***供应商美国NewEastBio在中国的子公司。公司位于武汉东湖高新技术开发区光谷生物城.美国NewEastBio专注于生命科学和生物技术领域，主要产品有小分子、ELISA***盒、蛋白等，与世界高校和研究所、世界大制药公司、生物科技公司和***等客户建立了长期稳定的合作关系，产品销往各地。

产品描述

Arf样蛋白1（Arl1）是调节性gtpase家族中的一员，位于Ras中GTPases的超家族，在真核生物中具有高度保守的同源***。Arl1至关重要用于果蝇和秀丽隐杆线虫的早期胚胎发育。Arl1在一级序列，细胞位置和功能（膜交通的调节）到Arf1–6甚至共享几个共同的有约束力的合作伙伴。除了在膜交通中的作用高尔基/跨高尔基网络，有报道表明Arl1可能在离子稳态中起作用酵母。