这些抗Arf 6-GTP单克l隆抗l体还可用于通过免l疫***化学监测细胞和***中Arf 6的激l活。

NewEast Biosciences Arf6激l活测定***盒提供了一种简单且快速的方法来监测Arf 6的激l活。每个***盒均提供足够的量以执行20个测定。

NewEast Biosciences Arf 6激l活检测***盒基于特定于配置的抗Arf 6-GTP单克l隆抗l体，可从细胞提取物或体外载有GTPγS的Arf 6激l活检测方法来测量活性Arf 6-GTP水平。 简而言之，抗活性的Arf 6小鼠单克l隆抗l体将与含有Arf 6-GTP的细胞裂解液一起孵育。 然后，结合的活性Arf 6将被蛋白A / G琼脂糖拉低。 分别使用抗Arf 6兔多克l隆抗l体通过免l疫印迹分析检测沉淀的活性Arf 6。

***准备

?1X测定/裂解缓冲液：短暂混合5X储备液，并在去离子水中稀释至1X。 在使用前，添加蛋白酶***l剂，例如1 mM PMSF，10 μg / mL亮肽素和10 μg / mL抑肽酶。

1.将细胞（一块10厘米长的平板，约107个细胞）培养至约80-90％汇合。根据需要用活化剂或***l剂刺激细胞。

2.吸出培养基，并用冰冷的PBS洗涤两次。

3.完全除去PBS洗涤液，然后向细胞中加入冰冷的1X分析/裂解缓冲液（每10 cm***培养板0.5-1 mL）。

4.将培养板放在冰上10-20分钟。

5.用刮板将其从平板上取下。

6.将裂解物转移至适当大小的试管中，并置于冰上。

7.如果发生核裂解，则细胞裂解液可能变得非常粘稠，难以移液。如果发生这种情况，可将裂解液通过27?号注l射器针头3-4次以剪切***组DNA。

8.通过离心10分钟（在4°C下为12,000 x g）清除裂解物。

9.收集上清液并将样品（约1-2 mg的总蛋白）存储在冰上以立即使用，或速冻并存储在-70°C以便将来使用。

小G蛋白是从属于细胞调节因子中的一个超家族。Rho家族是小G蛋白中的一个亚家族，它在细胞运动、细胞分裂以及***转录中发挥主要作用。而本***盒中的Cd***2就属于Rho亚家族中的一种， Cd***2参与生理活动过程中其分子结构会呈现出2种相互转换的形式：与GTP结合的激l活状态和与GDP结合的非活性状态。

目前Cd***2蛋白活性的检测主要是依据小GTP酶Cd***2可以与p21活化激酶（PAK）的p21结合区域（PBD）结合，使PAK活化从而发挥生物学功能，进而间接的进行Cd***2活性l功能的监测。然而此方法在检测过程中存在着一定的局限性比如GTP水解成GDP的速度过快以及Cd***2-GTP结合蛋白与p21结合区域之间较低的亲和力，导致这种检测方法的重复性较差。

武汉纽斯特生物科技有限公司（WuhanNewEastBiotechonologyCo.Ltd），系美国生命科学***供应商美国NewEastBio在中国的子公司。美国NewEastBio专注于生命科学和生物技术领域，主要产品有小分子、ELISA***盒、蛋白等。

悬浮细胞

1.培养细胞并根据需要用活化剂或***l剂刺激。

2.进行细胞计数，然后通过离心沉淀细胞。

3.吸出培养基，并用冰冷的PBS洗涤两次。

4.完全除去PBS洗涤液，然后向细胞沉淀中加入冰冷的1X分析/裂解缓冲液

   （每1 x 107池0.5 – 1 mL）。

5.通过重复移液裂解细胞。

7.如果发生核裂解，则细胞裂解液可能变得非常粘稠，难以移液。如果这

   发生时，裂解液可通过27?号***l器针头3-4次以剪切

   ***组DNA。

9.收集上清液并将样品保存在冰上以备立即使用，或速冻并保存在-

   70°C以备将来使用。

阳性和阴性对照的体外GTPγS/ GDP蛋白质上样量

    注意：体内刺激细胞会激l活大约10％的可用Rab35，而

    体外GTPγS蛋白负载将激l活近90％的Rab35。

1.将0.5 ml每种细胞提取物等分到两个微量离心管中（或使用1 μg纯化的Rab35蛋白）。

2.向每个试管中加入20 μl 0.5 M EDTA（至20 mM终浓度）。

3.将5 μl 100 XGTPγS（至100 μM，终浓度）加到一个试管中（阳性对照）。

4.在第二个试管中加入5 μl 100 X GDP（至1 mM，终浓度）（阴性对照）。

5.在搅拌下将试管在30°C孵育30分钟。

6.通过将试管放在冰上并添加32.5 μl 1 M MgCl2（至60 mM）。