***准备

?1X测定/裂解缓冲液：短暂混合5X储备液，并在去离子水中稀释至1X。 在使用前，添加蛋白酶***l剂，例如1 mM PMSF，10 μg / mL亮肽素和10 μg / mL抑肽酶。

1.将细胞（一块10厘米长的平板，约107个细胞）培养至约80-90％汇合。根据需要用活化剂或***l剂刺激细胞。

2.吸出培养基，并用冰冷的PBS洗涤两次。

3.完全除去PBS洗涤液，然后向细胞中加入冰冷的1X分析/裂解缓冲液（每10 cm***培养板0.5-1 mL）。

4.将培养板放在冰上10-20分钟。

5.用刮板将其从平板上取下。

6.将裂解物转移至适当大小的试管中，并置于冰上。

7.如果发生核裂解，则细胞裂解液可能变得非常粘稠，难以移液。如果发生这种情况，可将裂解液通过27?号注l射器针头3-4次以剪切***组DNA。

8.通过离心10分钟（在4°C下为12,000 x g）清除裂解物。

9.收集上清液并将样品（约1-2 mg的总蛋白）存储在冰上以立即使用，或速冻并存储在-70°C以便将来使用。

 1.抗活性的Arl1，小鼠单克l隆抗l体（货号26924）：一小瓶–溶于pH 7.4的PBS中的22 μL（1mg / ml），含有50％甘油和0.05％叠氮l化钠。该抗l体特异性识别所有脊椎动物的Arl1-GTP。

2.蛋白A / G琼脂糖（目录号30301）：一小瓶– 400 μL 50％浆液。

3. 5X测定/裂解缓冲液（目录号30302）：一瓶– 30 mL的250 mM Tris-HCl，pH 8，750mM N***，50 mM MgCl2，5 mM EDTA，5％Triton X-100。

4.抗Arl1，小鼠单克l隆抗l体（目录号26056）：一小瓶– 100 μL（1 mg / ml）

pH 7.4的PBS中含有50％的甘油。

5. 100 XGTPγS（货号30303）：1瓶– 100 μl，10 mM，使用5 μLGTPγSGTP标记的0.5 mL细胞裂解物。

6. 100 X GDP（产品目录号30304）：一个样品瓶– 100 μl，100 mM，使用5 μL GDP

GDP标记的0.5 mL细胞裂解物。

1.刺激的和非刺激的细胞裂解液

2.蛋白酶***l剂

3. 4°C管摇杆或摇床

4. 0.5 M EDTA，pH8.0

5. 1 M氯化镁

6. 2倍还原SDS-PAGE样品缓冲液

7.电泳和免l疫印迹系统

8.免l疫印迹洗涤缓冲液，例如TBST（10 mM Tris-HCl，pH 7.4，0.15 M N***，0.05％Tween-20）

9.免l疫印迹封闭缓冲液（TBST包含5％脱脂奶粉或3％BSA）

10. PVDF或硝l酸纤维素膜

11.二抗

12. ECL检测***

电泳和转移

1向聚丙l烯酰胺凝胶（17%）中加入15μL/孔的下拉上清液。而且建议包括预染色MW标准（作为成功转入的指标步骤3）。

2按照制造商的说明进行SDS-PAGE。

3按照制造商的说明，将凝胶蛋白转移到PVDF或硝化纤维膜上说明。

免l疫印迹检测（所有步骤均在室温下搅拌）

1在电印迹步骤之后，将PVDF膜浸入100%甲l醇中15次

然后在室温下干燥5分钟。

如果使用硝基纤维素，则应跳过此步骤。

2室温下用5%脱脂奶粉或3%牛血l清白蛋白在TBST中封闭1小时

不断地搅动。

用抗Arl1单克l隆抗l体孵育，新鲜稀释1:50~1000

（取决于样品中Arl1蛋白质的含量）5%脱脂奶粉或3%

BSA/TBST，室温下持续搅拌1-2小时或4o

过夜。

3用TBST清洗吸水膜三次，每次5分钟。

4用二级抗l体（例如山羊抗鼠IgG，HRP结合物）培养膜，

在室温下，在5%脱脂奶粉或3%BSA/TBST中新鲜稀释1:1000，1小时

5用TBST清洗吸水膜三次，每次5分钟。

6使用您选择的检测方法，如ECL。