1.抗活性Arf 6，小鼠单克l隆抗l体（货号26918）：一小瓶– 22 μL（1

含50％甘油和0.05％叠氮l化钠的PBS（pH 7.4）中的浓度（mg / ml）。 该抗l体特异性识别所有脊椎动物的Arf 6-GTP。

2.蛋白A / G琼脂糖（目录号30301）：一小瓶– 400 μL 50％浆液。

3. 5X测定/裂解缓冲液（目录号30302）：一瓶– 30 mL的250 mM Tris-HCl，pH 8，750mM N***，50 mM MgCl2，5 mM EDTA，5％Triton X-100。

4.抗Arf 6，兔多克l隆抗l体（货号21032）：一小瓶– 100 μL（1 mg / ml）

pH 7.4的PBS中含有50％的甘油。

5. 100 XGTPγS（目录号30303）：1瓶– 100 μl，10 mM，使用5 μLGTPγS标记0.5 mL细胞裂解液。

6. 100 X GDP（产品目录号30304）：一个样品瓶– 100 μl，100 mM，使用5 μL GDP标记0.5 mL细胞裂解物。

体外用GTPγS/GDP处理蛋白以用作阳性和阴性的对照

注意：在细胞体内环境条件下大约有10%的Cd***2被激l活，而在体外用GTPγS处理大约有90%的Cd***2被激l活。

1. 准备两个离心管，每个管中各加入0.5 mL的细胞提取物（如果是纯的Cd***2蛋白则每个管中加入的蛋白量为1ug）。

2. 每个管中加入20ul 0.5M EDTA(终浓度即为20 mM)。

3. 一个管中加入5ul的100X GTPγS（终浓度即为100 uM）作为阳性对照。另一个管中加入5ul的100X GDP（终浓度即为1 mM）作为阴性对照。

4. 将离心管置于30°C条件下反应30min并不断搅动。

5. 终止反应：将管置于冰上并加入32.5ul 1M MgCl2(终浓度即为60mM)。

GTPases的Rab家族调节真核水泡膜运输。 Rab35与两个血浆

膜和内体***，并涉及到包括T细胞受体回收，卵母细胞卵黄蛋白回收和胞质分裂在内的各种过程。 Rab35调节***元样细胞中的***突生长，并可以诱导突起。

当前没有直接测定法来测量Rab35 GTPases的活化。

NewEast Biosciences Rab35激l活检测***盒基于特定于配置的单克l隆

特异性识别Rab35 GTP而不识别Rab Rab35 GDP的抗l体。鉴于...的高度亲和力

抗原的单克l隆抗l体，可以在短时间内进行激l活测定。这个

分析提供了可靠的结果，并具有一致的可重复性。

这些抗Rab35 GTP单克l隆抗l体也可以用于监测大鼠Rab35的激l活。

1细胞和***中的免l疫***化学。

NewEast Biosciences Rab35激l活检测***盒提供了一种简单快速的方法来监测

Rab35的激l活。每个***盒均提供足够的量以执行20个测定。

武汉纽斯特生物科技有限公司（WuhanNewEastBiotechonologyCo.Ltd），系美国生命科学***供应商美国NewEastBio在中国的子公司。美国NewEastBio专注于生命科学和生物技术领域，主要产品有小分子、ELISA***盒、蛋白等。

悬浮细胞

1.培养细胞并根据需要用活化剂或***l剂刺激。

2.进行细胞计数，然后通过离心沉淀细胞。

3.吸出培养基，并用冰冷的PBS洗涤两次。

4.完全除去PBS洗涤液，然后向细胞沉淀中加入冰冷的1X分析/裂解缓冲液

   （每1 x 107池0.5 – 1 mL）。

5.通过重复移液裂解细胞。

6.将裂解物转移至适当大小的试管中，并置于冰上。

7.如果发生核裂解，则细胞裂解液可能变得非常粘稠，难以移液。如果这

   发生时，裂解液可通过27?号***l器针头3-4次以剪切

   ***组DNA。

8.通过离心10分钟（在4°C下为12,000 x g）清除裂解物。

9.收集上清液并将样品保存在冰上以备立即使用，或速冻并保存在-

   70°C以备将来使用。

阳性和阴性对照的体外GTPγS/ GDP蛋白质上样量

    注意：体内刺激细胞会激l活大约10％的可用Rab35，而

    体外GTPγS蛋白负载将激l活近90％的Rab35。

1.将0.5 ml每种细胞提取物等分到两个微量离心管中（或使用1 μg纯化的Rab35蛋白）。

2.向每个试管中加入20 μl 0.5 M EDTA（至20 mM终浓度）。

3.将5 μl 100 XGTPγS（至100 μM，终浓度）加到一个试管中（阳性对照）。

4.在第二个试管中加入5 μl 100 X GDP（至1 mM，终浓度）（阴性对照）。

5.在搅拌下将试管在30°C孵育30分钟。

6.通过将试管放在冰上并添加32.5 μl 1 M MgCl2（至60 mM）。