武汉纽斯特生物科技有限公司（WuhanNewEastBiotechonologyCo.Ltd），系美国生命科学***供应商美国NewEastBio在中国的子公司。美国NewEastBio专注于生命科学和生物技术领域，主要产品有小分子、ELISA***盒、蛋白等。

悬浮细胞

1.培养细胞并根据需要用活化剂或***l剂刺激。

2.进行细胞计数，然后通过离心沉淀细胞。

3.吸出培养基，并用冰冷的PBS洗涤两次。

4.完全除去PBS洗涤液，然后向细胞沉淀中加入冰冷的1X分析/裂解缓冲液

   （每1 x 107池0.5 – 1 mL）。

5.通过重复移液裂解细胞。

6.将裂解物转移至适当大小的试管中，并置于冰上。

7.如果发生核裂解，则细胞裂解液可能变得非常粘稠，难以移液。如果这

   发生时，裂解液可通过27?号***l器针头3-4次以剪切

   ***组DNA。

8.通过离心10分钟（在4°C下为12,000 x g）清除裂解物。

9.收集上清液并将样品保存在冰上以备立即使用，或速冻并保存在-

   70°C以备将来使用。

阳性和阴性对照的体外GTPγS/ GDP蛋白质上样量

    注意：体内刺激细胞会激l活大约10％的可用Rab35，而

    体外GTPγS蛋白负载将激l活近90％的Rab35。

1.将0.5 ml每种细胞提取物等分到两个微量离心管中（或使用1 μg纯化的Rab35蛋白）。

2.向每个试管中加入20 μl 0.5 M EDTA（至20 mM终浓度）。

3.将5 μl 100 XGTPγS（至100 μM，终浓度）加到一个试管中（阳性对照）。

4.在第二个试管中加入5 μl 100 X GDP（至1 mM，终浓度）（阴性对照）。

5.在搅拌下将试管在30°C孵育30分钟。

6.通过将试管放在冰上并添加32.5 μl 1 M MgCl2（至60 mM）。

目前还没有直接测定Arl1-gtpase活性的方法。NewEast Biosciences Arl1激l活检测***盒是基于特定构型的单克l隆抗l体特异性识别Arl1 GTP，但不识别Arl1 GDP的抗l体。鉴于克l隆抗l体对其抗原，活化试验可在短时间内进行。这个分析结果可靠，重现性一致。

这些抗Arl1-GTP单克l隆抗l体也可用于监测细胞中Arl1的激l活免l疫***化学检测。NewEast Biosciences Arl1激l活分析***盒提供了一种简单、快速的方法来监测激l活Arl1。每个***盒提供足够的量来进行20次分析。

分析原理

NewEast Biosciences Arl1激l活检测***盒基于配置特异性抗Arl1-GTP从细胞提取物或体外检测活性Arl1-GTP水平的单克l隆抗l体GTPγS负载Arl1活化分析。简而言之，抗活性Arl1小鼠单克l隆抗l体将用含有Arl1-GTP的细胞裂解液培养。然后，绑定的活动Arl1将被下拉蛋白质A/G琼脂糖。用抗Arl1兔多克l隆抗l体或抗Arl1小鼠单克l隆抗l体进行免l疫印迹分析，检测沉淀的活性Arl1。

需要但未提供的材料

1刺激性和非刺激性细胞裂解物

2蛋白酶***素

4°C摇管器或振动筛

40.5 M EDTA，pH8.0

51百万氯化镁

62X还原SDS-PAGE样品缓冲液

7电泳和免l疫印迹系统

8免l疫印迹洗涤缓冲液，如TBST（10 mM Tris HCl，pH 7.4，0.15 M N***，0.05%

吐温-20）

9免l疫印迹阻断缓冲液（含5%脱脂奶粉或3%牛血l清白蛋白的TBST）

10PVDF或硝化纤维膜

11次级抗l体

12ECL检测***

Gα13活化试验。MEF细胞分别用LPA（第2道）或不加LPA（1道）处理。细胞裂解物用抗活性Gα13单克l隆抗l体（Cat）孵育。#26902）（顶面板）。这个用抗Gα13兔多克l隆抗l体（Cat）免l疫印迹法检测沉淀活性Gα13#21005年）。底部的面板显示了用抗Gα13的细胞裂解物的Western blot（5%在顶部面板中使用的）。