1.刺激的和非刺激的细胞裂解液

2.蛋白酶抑l制剂

3. 4°C管摇杆或摇床

4. 0.5 M EDTA，pH8.0

5. 1 M氯化镁

6. 2倍还原SDS-PAGE样品缓冲液

7.电泳和免l疫印迹系统

8.免l疫印迹洗涤缓冲液，例如TBST（10 mM Tris-HCl，pH 7.4，0.15 M N***，0.05％

吐温20）

9.免l疫印迹封闭缓冲液（TBST包含5％脱脂奶粉或3％BSA）

10. PVDF或硝l酸纤维素膜

11.二抗

12. ECL检测***

GTPases的Rab家族调节真核水泡膜运输。 Rab35与两个血浆

膜和内体***，并涉及到包括T细胞受体回收，卵母细胞卵黄蛋白回收和胞质分裂在内的各种过程。 Rab35调节***元样细胞中的***突生长，并可以诱导突起。

当前没有直接测定法来测量Rab35 GTPases的活化。

NewEast Biosciences Rab35激l活检测***盒基于特定于配置的单克l隆

特异性识别Rab35 GTP而不识别Rab Rab35 GDP的抗l体。鉴于...的高度亲和力

抗原的单克l隆抗l体，可以在短时间内进行激l活测定。这个

分析提供了可靠的结果，并具有一致的可重复性。

这些抗Rab35 GTP单克l隆抗l体也可以用于监测大鼠Rab35的激l活。

1细胞和***中的免l疫***化学。

NewEast Biosciences Rab35激l活检测***盒提供了一种简单快速的方法来监测

Rab35的激l活。每个***盒均提供足够的量以执行20个测定。

分析原理

NewEast Biosciences Arl1激l活检测***盒基于配置特异性抗Arl1-GTP从细胞提取物或体外检测活性Arl1-GTP水平的单克l隆抗l体GTPγS负载Arl1活化分析。简而言之，抗活性Arl1小鼠单克l隆抗l体将用含有Arl1-GTP的细胞裂解液培养。然后，绑定的活动Arl1将被下拉蛋白质A/G琼脂糖。用抗Arl1兔多克l隆抗l体或抗Arl1小鼠单克l隆抗l体进行免l疫印迹分析，检测沉淀的活性Arl1。

需要但未提供的材料

1刺激性和非刺激性细胞裂解物

2蛋白酶***素

4°C摇管器或振动筛

40.5 M EDTA，pH8.0

51百万氯化镁

62X还原SDS-PAGE样品缓冲液

7电泳和免l疫印迹系统

8免l疫印迹洗涤缓冲液，如TBST（10 mM Tris HCl，pH 7.4，0.15 M N***，0.05%

吐温-20）

9免l疫印迹阻断缓冲液（含5%脱脂奶粉或3%牛血l清白蛋白的TBST）

10PVDF或硝化纤维膜

11次级抗l体

12ECL检测***

电泳和转移

1向聚丙l烯酰胺凝胶（17%）中加入15μL/孔的下拉上清液。而且建议包括预染色MW标准（作为成功转入的指标步骤3）。

2按照制造商的说明进行SDS-PAGE。

3按照制造商的说明，将凝胶蛋白转移到PVDF或硝化纤维膜上说明。

免l疫印迹检测（所有步骤均在室温下搅拌）

1在电印迹步骤之后，将PVDF膜浸入100%甲l醇中15次

然后在室温下干燥5分钟。

如果使用硝基纤维素，则应跳过此步骤。

2室温下用5%脱脂奶粉或3%牛血l清白蛋白在TBST中封闭1小时

不断地搅动。

用抗Arl1单克l隆抗l体孵育，新鲜稀释1:50~1000

（取决于样品中Arl1蛋白质的含量）5%脱脂奶粉或3%

BSA/TBST，室温下持续搅拌1-2小时或4o

过夜。

3用TBST清洗吸水膜三次，每次5分钟。

4用二级抗l体（例如山羊抗鼠IgG，HRP结合物）培养膜，

在室温下，在5%脱脂奶粉或3%BSA/TBST中新鲜稀释1:1000，1小时

5用TBST清洗吸水膜三次，每次5分钟。

6使用您选择的检测方法，如ECL。