***准备

?1X测定/裂解缓冲液：短暂混合5X储备液，并在去离子水中稀释至1X。 在使用前，添加蛋白酶***l剂，例如1 mM PMSF，10 μg / mL亮肽素和10 μg / mL抑肽酶。

1.将细胞（一块10厘米长的平板，约107个细胞）培养至约80-90％汇合。根据需要用活化剂或***l剂刺激细胞。

2.吸出培养基，并用冰冷的PBS洗涤两次。

3.完全除去PBS洗涤液，然后向细胞中加入冰冷的1X分析/裂解缓冲液（每10 cm***培养板0.5-1 mL）。

4.将培养板放在冰上10-20分钟。

5.用刮板将其从平板上取下。

6.将裂解物转移至适当大小的试管中，并置于冰上。

7.如果发生核裂解，则细胞裂解液可能变得非常粘稠，难以移液。如果发生这种情况，可将裂解液通过27?号注l射器针头3-4次以剪切***组DNA。

8.通过离心10分钟（在4°C下为12,000 x g）清除裂解物。

9.收集上清液并将样品（约1-2 mg的总蛋白）存储在冰上以立即使用，或速冻并存储在-70°C以便将来使用。

阳性对照和阴性对照的体外GTPγS/ GDP蛋白质上样量

注意：体内细胞刺激将激l活可用Arf 6的大约10％，而体外GTPγS蛋白负载将激l活Arf 6的将近90％。

1，将0.5 ml每种细胞提取物等分到两个微量离心管中（或使用1 μg纯化的Arf 6蛋白）。

2，向每个试管中加入20 μl 0.5 M EDTA（终浓度为20 mM）。

3，将5 μl 100 XGTPγS（至100 μM，终浓度）加到一个试管中（阳性对照）。

4，在第二个试管中加入5 μl 100 X GDP（至1 mM，终浓度）（阴性对照）。

5，在搅拌下将试管在30°C孵育30分钟。

6，通过将试管放在冰上并添加32.5 μl 1 M MgCl2（至60 mM，终浓度）来停止加载。

免l疫印迹和检测（所有步骤均在室温下搅拌）

1.在电印迹步骤之后，将PVDF膜浸入100％甲l醇中15秒钟，然后使其在室温下干燥5分钟。注意：如果使用硝l酸纤维素代替PVDF，则应跳过此步骤。

2.在室温下不断搅拌下，在TBST中用5％脱脂奶粉或3％BSA封闭膜1小时。

将膜与抗Arf 6兔多克l隆抗l体在5％脱脂奶粉或3％BSA / TBST中以1：50?1000（取决于样品中Arf 6蛋白质的量）新鲜稀释，孵育1-在室温下持续搅拌2小时或过夜4oC。

3.用TBST将印迹的膜清洗3次，每次5分钟。

4.将膜与二抗（例如山羊抗兔IgG，HRP偶联物）一起孵育，在室温下以恒定的比例在5％脱脂奶粉或3％BSA / TBST中以1：1000的比例新鲜稀释。搅动。

5.用TBST将印迹的膜清洗3次，每次5分钟。

6.使用您选择的检测方法，例如ECL。