1.刺激的和非刺激的细胞裂解液

2.蛋白酶抑l制剂

3. 4°C管摇杆或摇床

4. 0.5 M EDTA，pH8.0

5. 1 M氯化镁

6. 2倍还原SDS-PAGE样品缓冲液

7.电泳和免l疫印迹系统

8.免l疫印迹洗涤缓冲液，例如TBST（10 mM Tris-HCl，pH 7.4，0.15 M NaCl，0.05％

吐温20）

9.免l疫印迹封闭缓冲液（TBST包含5％脱脂奶粉或3％BSA）

10. PVDF或硝l酸纤维素膜

11.二抗

12. ECL检测试剂

 1.抗活性的Arl1，小鼠单克l隆抗l体（货号26924）：一小瓶–溶于pH 7.4的PBS中的22 μL（1mg / ml），含有50％甘油和0.05％叠氮l化钠。该抗l体特异性识别所有脊椎动物的Arl1-GTP。

2.蛋白A / G琼脂糖（目录号30301）：一小瓶– 400 μL 50％浆液。

3. 5X测定/裂解缓冲液（目录号30302）：一瓶– 30 mL的250 mM Tris-HCl，pH 8，750mM NaCl，50 mM MgCl2，5 mM EDTA，5％Triton X-100。

4.抗Arl1，小鼠单克l隆抗l体（目录号26056）：一小瓶– 100 μL（1 mg / ml）

pH 7.4的PBS中含有50％的甘油。

5. 100 XGTPγS（货号30303）：1瓶– 100 μl，10 mM，使用5 μLGTPγSGTP标记的0.5 mL细胞裂解物。

6. 100 X GDP（产品目录号30304）：一个样品瓶– 100 μl，100 mM，使用5 μL GDP

GDP标记的0.5 mL细胞裂解物。

2.蛋白酶抑制l剂

8.免l疫印迹洗涤缓冲液，例如TBST（10 mM Tris-HCl，pH 7.4，0.15 M NaCl，0.05％Tween-20）

?1X测定/裂解缓冲液：短暂混合5X储备液，并在去离子水中稀释至1X。 在使用前，添加蛋白酶抑制l剂，例如1 mM PMSF，10 μg / mL亮肽素和10 μg / mL抑肽酶。

分析原理

NewEast Biosciences Arl1激l活检测试剂盒基于配置特异性抗Arl1-GTP从细胞提取物或体外检测活性Arl1-GTP水平的单克l隆抗l体GTPγS负载Arl1活化分析。简而言之，抗活性Arl1小鼠单克l隆抗l体将用含有Arl1-GTP的细胞裂解液培养。然后，绑定的活动Arl1将被下拉蛋白质A/G琼脂糖。用抗Arl1兔多克l隆抗l体或抗Arl1小鼠单克l隆抗l体进行免l疫印迹分析，检测沉淀的活性Arl1。

需要但未提供的材料

1刺激性和非刺激性细胞裂解物

2蛋白酶抑制素

4°C摇管器或振动筛

40.5 M EDTA，pH8.0

51百万氯化镁

62X还原SDS-PAGE样品缓冲液

7电泳和免l疫印迹系统

8免l疫印迹洗涤缓冲液，如TBST（10 mM Tris HCl，pH 7.4，0.15 M NaCl，0.05%

吐温-20）

9免l疫印迹阻断缓冲液（含5%脱脂奶粉或3%牛血l清白蛋白的TBST）

10PVDF或硝化纤维膜

11次级抗l体

12ECL检测试剂

Arl1激l活试验。纯化的GST标记的Arl1蛋白用抗活性Arl1单克l隆抗l体（Cat。#26924）用GDP（车道1）或GTPγS（车道2）处理后，用抗Arl1单克l隆抗l体（Cat）进行印迹。#26056年）。显示Arl1蛋白输入控制在底部面板中。

产品描述

Arf样蛋白1（Arl1）是调节性gtpase家族中的一员，位于Ras中GTPases的超家族，在真核生物中具有高度保守的同源基因。Arl1至关重要用于果蝇和秀丽隐杆线虫的早期胚胎发育。Arl1在一级序列，细胞位置和功能（膜交通的调节）到Arf1–6甚至共享几个共同的有约束力的合作伙伴。除了在膜交通中的作用高尔基/跨高尔基网络，有报道表明Arl1可能在离子稳态中起作用酵母。

目前还没有直接测定Arl1-gtpase活性的方法。NewEast Biosciences Arl1激l活检测试剂盒是基于特定构型的单克l隆抗l体特异性识别Arl1 GTP，但不识别Arl1 GDP的抗l体。鉴于单克l隆抗l体对其抗原，活化试验可在短时间内进行。这个分析结果可靠，重现性一致。