博日养殖场非洲***病毒检测信赖推荐「在线咨询」
作者:劢博仪器2020/6/2 21:40:34






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在PCR扩增中,溶液中的模板变性后低温退火时,引物与探针同时与模板结合。在引物的介导下,沿模板向前延伸至探针结合处,发生链的置换,Taq酶的5′-3′外切酶活性(此活性是双链特异性的,游离的单链探针不受影响)将探针5′端连接的荧光基团从探针上切割下来,游离于反应体系中,从而脱离3′端荧光淬灭基团的屏蔽,接受光刺激发出荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。相比其他环节,在生猪屠宰厂(场)开展检测更容易采集样品,实现***i大限度的检测覆盖面,结合临床和剖检情况综合判断。

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直接的方法指的是标记荧光的探针与扩增产物结合后即直接产生荧光,分子信标(molecular beacon)就属于这一类,它本质上是一种标记荧光的发夹探针,当探针分子呈发夹结构时,结合在其两端的荧光基团距离上接近,使得产生能量转移效应,而不发生荧光。当互补序列出现时,探针与DNA杂交,探针转变成一个开放的结构,呈线性,报告荧光基团与淬灭荧光基团彼此在空间上产生足够的分离,荧光基团脱离了淬灭基团的影响,从而产生可被检测到的荧光。目前在real-timeQ-PCR中***广泛使用的TaqMan系统就是运用了这个原理。


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在real-time Q-PCR技术中,无论是相对定量还是标准曲线定量方法仍存在一些PCR定量方法均有的问题有待解决。在标准曲线定量中,标准品的制备是一个必不可少的过程。目前由于无一统一标准,各个实验室所用的生成标准曲线的样品各不相同,致使实验结果缺乏可比性。此外,用real-time Q-PCR来研究mRNA时,受到不同RNA样本存在不同的逆转录(RT)效率的限制。因为每一个梯度要做三个重复,因此先在1ml的无菌离心管中配制好后再分装入96孔板中。在相对定量中,其前提是假设内源控制物不受实验条件的影响的,合理地选择合适的不受实验条件影响的内源控制物也是实验结果可靠与否的关键。

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与传统的PCR技术相比,Real-time Q-PCR的不足之处是:(1)由于运用了封闭的检测,减少了扩增后电泳的检测步骤,因此也就不能监测扩增产物的大小;(2)因为荧光素种类以及检测光源的局限性,从而相对地限制了real-time Q-PCR的复合式(multiplex)检测的应用能力;有人讲过普通PCR后,通过电泳也可以进行定量,其实是将PCR产物的定量与PCR样本中模板定量相混了。(3)目前real-time Q-PCR实验成本比较高,从而也限制了其广泛的应用。


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核酸的提取和纯化是法医DNA物证检验的关键技术之一,目前实验室***i常用的方法包括核酸纯化柱(Spin column)磁珠法和clean-up系统,磁珠法由于操作简便、快速,能够提取到高纯度的核酸DNA,并且可以自动化,因此成为目前法医DNA实验室核酸提取纯化的主要手段。但磁珠法由于磁珠吸附DNA分子的不均衡、且在后续洗脱过程中会造成核酸的断裂和损失,因此在疑难检材的检验过程中,存在PCR扩增失败, DNA检验不成功的情况。SYBR仅与双链DNA进行结合,因此可以通过溶解曲线,确定PCR反应是否特异。

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对猪场实行非瘟检测,并不是说要每天/每次都要进行检测,而是基于猪场各区域/途径的风险程度制定合适的检测频率,高风险区域检测频率相对而言要高些,如引种/车辆/精i液,建议每次采样检测,采购饲料/物资产品,建议先试用并隔离做检测,其余定期监测,检测频率可按每月或每周进行,具体可根据本场实际情况而定,可按照场内所划分的管理单元格进行全i方位的筛选,从而降低***传入风险。在real-timeQ-PCR中,对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号,随着反应时间的进行,监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。


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