CRISPR-Cas9***编辑2--gRNA设计(下)

粘贴事先准备好的序列--保存Oligo文件 （1）打开一个pSpCas9质粒--actin--restriction cloning--insert fragment （2）在Vector选项卡，选择内切酶为BbsI，在insert部分选择上一步中保存好的oligo，***后点击clone，保存DNA文件。

和ZFN，TALEN一样，CRISPR-Cas也是通过***DSB的模式来达到***标记的目的。CRISPR RNA (crRNA) array，编码gRNA，再加上tracrRNA，则可达到***+编辑的功能 gRNA用于引导，tracrRNA用于结合靶点。

蓝色是自己设计的20bp的gRNA序列；而切割位点在NGG的上游某个位置，_-20bp之间。有两种修复切口的方法：主要有2个使用方法：一个载体上2个gRNA的例子。几乎每种微生物都有自己的Cas9版本，大小和序列都不一样。

CRISPR-Cas9***编辑技术就是通过人工设计的 sgRNA(guide RNA)来识别目的***组序列，并引导 Cas9 蛋白酶进行有效切割 DNA 双链，形成双链断裂，损伤后修复会造成***敲除或敲入等，***终达到对***组DNA 进行修饰的目的。

CRISPR-Cas9 体系的 RNA-DNA 识别机制为***组工程研究提供了一项简便而强大的工具。该体系其中一个***重要的优势是 Cas9 蛋白可在多个不同的 gRNA 的引导下同时靶向多个***组位点。

想要获得高质量和可***的编辑细胞可能需要一定的经验和技术优化。

嵌套引物如何设计

1、巢式PCR一般是有两对引物的，一对outer引物，一对inner引物。

2、选择上方的红蓝双向箭头的按钮进行引物设计，在设计开始前可以更改设计的参数，包括搜索的碱基范围、引物的长度，碱基数，设计结果显示的引物对数等。设置完参数后，点击下方的Search，软件开始分析设计，完成后，点击OK。

3、引物设计需要注意的地方很多，在大多数情况下，我们都是在知道已知模板序列时进行PCR扩增的。设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。

4、***的0版注册一下就能用了，应该有中文说明设计引物的方法，看说明学习一下就可以了。

PCR的引物怎样设计,

1、序列特异性：引物设计完毕请使用 NCBI BLAST功能检索引物特异性，以避免非特异性扩增产生。注意： PCR的产量通常取决于PCR引物的3’端，引物间形成二聚体会降低扩增效率。

2、PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。

3、引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。

4、PCR是分子生化学生必备技能，简单朴实但是必不可少，是许多分子实验进行下去冲锋员。