1)将融合基因(待测植物蛋白质基因-报告基因)克隆到植物表达载体,得到重组表达载体;2)将重组表达载体转化农,得到重组农;3)向重组农中加入农侵染缓冲液,调节OD600为0.1~0.3,20-25℃静置1-2h,得到侵染菌液;4)用针头在植物叶片上避开叶脉扎孔,用无针头将侵染菌液从扎孔处注射至植物叶片内;5)培养植物2天,从注射部位取1-2cm2叶片;根据报告基因检测待测植物蛋白质在植物中的亚细胞定位。亚细胞定位要研究蛋白质的细胞定位,是在外面完成的一种实验,不能再体内蛋白质细胞中完成,所以,研究的成本比较高,对专业知识的要求比较高。实验证明,本方法具操作简单、快速、标记效果好、重复性好的优点;还可用于基因表达调控及内含子功能研究等,对研究新基因功能和表达调控奠定了技术基础。
蛋白亚细胞定位主要有两种方法,一种是结果准确但费时费力的实验验证方法,如荧光蛋白标记与Western/SDS-PAGE等;第二种方法是通过生物信息学手段,借助计算机对蛋白的亚细胞定位信息进行预测,这种方法可以在短时间获得大量蛋白的预测信息,而我们今天介绍的是便是第二种方法。而在对细胞内不同隔室间信号传递的分析中发现,大型细胞隔室的作用非常突出,特别是跟分泌途径相关,或者不同隔室之间信号传递有关。目前常用的亚细胞定位分析软件主要采用三种分析策略:N端排序或信号分子序列分析;氨基酸序列组成分析;结合多种策略(N端信号序列,氨基酸序列组成,功能域,相似度,GO分类)的分析。
通过对目的蛋白的标记,例如融合绿色荧光蛋白GFP,使用扫描共聚焦显微镜激发荧光,从而对蛋白的表达分布予以确认。实验流程:实验细节沟通——订单/实验材料确认,签订合同——全基因合成或者基因*(如果客户未提供测序完成的目标基因)——实验设计——过表达载体构建——遗传转化/瞬时转化——激光共聚焦观察拍摄照片亚细胞定位(后两步为可选项)。依据对亚细胞分布的准确度不同,亚细胞定位的实验设计也分成简化型亚细胞定位分析和内参型共定位分析。对于植物蛋白的亚细胞定位分析,主要通过构建融合荧光蛋白的过表达质粒,转化烟1草和原生质体瞬时表达体系确定其定位及共定位情况。
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