反相色谱影响因素(1)柱长有机小分子和肽类的分辨率随柱长的增加而增加．但是柱长增加并不能使蛋白质和核酸等生物大分子的分辨率显著增加．它们在较短的柱子上往往也有很好的分离效果。色谱法应用于分析领域使得分离和测定的过程合二为一，降低了混合物分析的难度缩短了分析的周期，是比较主流的分析方法。(2)流动相的流速。有机小分子和肽类的分辨率对流动相流速非常敏感。而蛋白质和核酸等生物大分子的分辨率则不然。流速越小，柱子越长，色谱峰的宽度就越大，分辨率就越小。制备色谱上样过程中的流速对动态吸附容量影响很大。(3)温度。温度上升，流动相黏度下降，流动速度加快，且流动相与固定相之间的传质速度加快，使分辨率增加。同时，温度上升，分子热运动增加，疏水性作用减弱。升高温度要考虑目标物质的热稳定性。(4)流动相组成。流动相的极性越大，溶质的分配系数越大，洗脱时间越长。RPC多采用降低流动相极性(水含量)的线性梯度洗脱法。水是极性强的溶剂，在反相色谱中常常和基础溶剂配合使用，向流动相中加入不同浓度的、可以与水混溶的有机溶1剂，以得到不同强度的流动相，这些有机溶1剂称为修饰剂。反相色谱中的有机溶1剂。此外，乙醇、四氢呋1喃、异丙1醇及二氧六环也常被用作修饰剂。有机溶1剂梯度的大小也会影响分辨率，一般梯度越小，分辨率越大。

漏液：

液相色谱仪从流动相瓶到废液瓶之间的流路是一个全封闭体系，内部压力很高，但外部却能保证一滴不漏。如果某个部件发生漏液，那就是故障所在。

漏液的原因分两种：

接触硬件不当：在更换零件如流路管或换柱时，换的接头接口不匹配，造成漏液。即使是有些固态微粒杂质，也能在液相流路系统的过滤头上排除，真正容易引起问题的，是水中的***。要注意不同公司的柱子接头很多是不同的，甚至同一家公司在不同时期生产的液相柱接头也有很大区别。当然选项用PEEK接头是一较好是一个较好的解决方法，不仅通用性好，而且靠手拧就能保证不漏液。即使是接口本身是匹配的，但是如果操作不当也会漏液，一种不当就是力度把握不好，拧得太紧或太松；另一种不当就是致命的错误：滑丝，这往往是动手能力不太强，螺丝钉很少拧的工作者犯的错误，滑丝的后果不仅是漏液那么简单，常造成重要部件的报废。解决这个问题只能靠恶补基本功来实验，那就是拧螺丝。

国产液相色谱仪借助于HPLC（液相色谱）的理论及原理，涵盖了小颗粒填料、低系统体积、耐高压及快速检测手段等全新技术，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量。2、亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱，极性柱称正相柱，正相柱的底剂用低极性溶剂，洗脱剂用极性较强的溶剂。 　　国产液相色谱仪的应用范围：　　可分析极性、弱极性或非极性的有机化合物，热稳定性差的化合物以及具有生物活性的生物分子。广泛应用于核酸、肽类、内酯、稠环芳烃、高聚物、、***代谢产物、表面活性剂、***、除莠剂等物质的定性和定量分析。例如、多环芳香化合物、甾体化合物、、色素、防腐剂、有机酸、***、糖类、蛋白质、氨基酸、肽、酶等，还可进行样品的纯化、手性的拆分等。

液相色谱仪的常规操作及维修：　　1、过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。　　2、对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。另外，如果在很低的温度下，基线信号值明显的大于初始值，那么有可能是色谱柱和GC系统有污染。　　3、打开HPLC工作站，连接好流动相管道，连接检测系统。　　4、进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。　　5、有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10ml/min。　　6、调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。　　7、设计走样方法。点击file，选取se-lectusersandmethods，可以选有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击newmethod。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a、进样前的稳流，一般2-5分钟；b、基线归零；c、进样阀的loading-inject转换；d、走样时间，随不同的样品而不同。　　8、进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击trun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。　　9、关机时，先关计算机，再关液相色谱。