反相色谱影响因素(1)柱长有机小分子和肽类的分辨率随柱长的增加而增加．但是柱长增加并不能使蛋白质和核酸等生物大分子的分辨率显著增加．它们在较短的柱子上往往也有很好的分离效果。(2)流动相的流速。有机小分子和肽类的分辨率对流动相流速非常敏感。而蛋白质和核酸等生物大分子的分辨率则不然。流速越小，柱子越长，制备液相色谱分离纯化，色谱峰的宽度就越大，分辨率就越小。制备色谱上样过程中的流速对动态吸附容量影响很大。(3)温度。温度上升，流动相黏度下降，流动速度加快，且流动相与固定相之间的传质速度加快，使分辨率增加。同时，温度上升，分子热运动增加，疏水性作用减弱。升高温度要考虑目标物质的热稳定性。(4)流动相组成。流动相的极性越大，溶质的分配系数越大，洗脱时间越长。RPC多采用降低流动相极性(水含量)的线性梯度洗脱法。水是极性强的溶剂，在反相色谱中常常和基础溶剂配合使用，向流动相中加入不同浓度的、可以与水混溶的有机溶1剂，以得到不同强度的流动相，这些有机溶1剂称为修饰剂。反相色谱中的有机溶1剂。此外，乙醇、四氢呋1喃、异丙1醇及二氧六环也常被用作修饰剂。有机溶1剂梯度的大小也会影响分辨率，一般梯度越小，分辨率越大。


低压色谱（LPLC）柱压一般低于5bar（或75psi）。 低压色谱一般是由蠕动泵、进样阀和检测器组成，可以连续化，实现自动的梯度淋洗和馏分收集等操作。色谱柱管一般是玻璃或聚合物材料的，长度一般为240-440mm，内径为10-40mm。 对于大多数在紫外区有吸收的物质，光学检测器很常用。填料一般使用软质的葡聚糖、琼脂糖、纤维素、合成高聚物或离子交换剂，粒径一般为40-60μm。
色谱法的分离方法，有柱色谱法、纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、***液相色谱法等。色谱所用溶剂应与试样不起化学反应，并应用纯度较高的溶剂。色谱时的温度，除气相色谱法或另有规定外，系指在室温下操作。分离后各成分的检出，应采用各单体中规定的方法。通常用柱色谱、纸色谱或薄层色谱分离有色物质时，可根据其色带进行区分，对有些无色物质，可在245-365nm的紫外灯下检视。纸色谱或薄层色谱也可喷显色剂使之显色。薄层色谱还可用加有荧光物质的薄层硅胶，采用荧光熄灭法检视。用纸色谱进行定量测定时，可将色谱斑点部分剪下或挖取，用溶剂溶出该成分，再用分光光度法或比色法测定，也可用色谱扫描仪直接在纸或薄层板上测出，也可用色谱扫描仪直接以纸或薄层板上测出。柱色谱、气相色谱和***液相色谱可用接于色谱柱出口处的各种检测器检测。柱色谱还可分部收集流出液后用适宜方法测定。


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