世界的能力和克服困难的勇气。每次磨难之后都会促进人类对自然界认知进一步加深,终找到解决问题的方法。比如说人类在长时间遭受***感l染引发的肺结l核、炭l疽等各种***的磨难后,后发现了抗l生素,基本消灭了这类病菌引发的各种***极大延长人类寿命。 相信随着科学家对病毒深入的研究并了解病毒的引起***的作用机理,终会找到治l疗方法。l像研究其它生物物体一样,要对病毒进行详细研究,首要的任务必须把病毒分离出来。由于病毒尺寸比蛋白抗l体分子更大,结构更复杂,其分离纯化也面临更大挑战。本文简单地介绍一下病毒及类病毒的分离纯化技术发展状况。
以纯化溶瘤病毒为例,由于其在生产过程中存在宿主蛋白等杂质,纯化前 SEC测试纯度为6.5%。纯化采用两种基质相同的介质,其表面化学功能也很一致,主要区别是前者是无孔实心的层析介质,而后者是传统的多孔层析介质。层析纯化的方法是阴离子交换吸附然后梯度洗脱(Bind-elute)模式。从层析图谱可以看出,在洗脱及CIP过程中无孔介质洗脱杂质更小,峰值更低,意味着上样过程中结合的杂质会更少,有利于表面结合的病毒分子纯化。通过对层析洗脱液SEC纯度分析比较,发现用传统的多孔层析介质实验得到的病毒样品纯度为54%(图 ),而用无孔的同类型介质实验得到的病毒纯度达到接近90%(图 )。
抗l体的层析分离步骤基本都可以采用标准化的三步曲:步用Protein A介质进行抗l体捕获和浓缩;第二步用离子交换进行中间纯化以去除多聚体,宿主蛋白等杂质;第三步是精纯去除剩余DNA,Endotoxin,Protein A 等微量杂质。在这三步抗l体的分离纯化过程中,步的Protein A亲和捕获占据分离纯化成本80%以上,也是下游分离纯化的瓶颈所在。亲和层析之所以成本高的主要原因:首先是Protein A 价格昂贵,其价格是普通层析介质十几倍;第二,Protein A使用寿命短,一般离子交换填料使用寿命多达1000次,而亲和填料寿命通常在100-200次;第三,Protein A 用于抗l体的捕获和浓缩,需要处理大体积的发酵液,而亲和步骤载量往往又低于阴阳离子交换层析,使得亲和层析介质使用量比中间纯化或精纯的要多得多。因此,要降低抗l体的生产成本,解决抗l体的生产瓶颈关键在于改进步Protein A 亲和捕获。
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