OmniFluo900系列稳态瞬态荧光光谱仪

OmniFluo900系列荧光光谱仪拥有稳态荧光和瞬态荧光光谱仪两大系列产品。本系统以高性能Omni-λ 系列单色/光谱仪、高亮度复色光源及多波长单色光源、高灵敏度单光子探测器和大容量样品室为主要核心部件，配合精心优化的激发与发射光路设计，显著地提高了荧光信号探测的灵敏度，纯水拉曼信噪比可达10,000：1 以上。这里我们选用卓立汉光的OmniFluo组合式荧光光谱系统的实测数据来比较这两种算法的差异性。

OmniFluo900系列以模块化设计为原则，以我公司 15 年丰富的光谱系统设计、制造及品控经验为基础，搭配时间分辨率达到皮秒量级多通道扫描单光子计数器，可方便地实现荧光（PL）光谱、激光诱导荧光（LIF）光谱、电致发光（EL）光谱及荧光量子产率（QY）等多种稳态、瞬态测试功能。相对于TCSPC，MCS对光源的重复频率几乎没有特殊的要求，只要满足样品寿命的采集周期即可。

***artFluo系列稳态荧光光谱仪

应用领域举例：

· 生***学：细胞毒性，离子浓度定量分析，细胞增殖，DNA定量，化学定量分析等

· 环境监测：各种微量药残留检测，水质评测，食品安全监管，污染物分析等

· 药开发及药理学：常规药分析，蛋白质新药开发，生物体系中的药作用机理，喹诺酮类药，毒检测，高通量筛选等

· 食品科学与农业：食品保质期评估，***生长测量，***分析，食品质量控制等

瞬态荧光amp;时间分辨荧光光谱实现方案

1 瞬态荧光：

有别于稳态荧光，瞬态荧光主要通过脉冲光源、快速探测器获取样品由激发态回迁到稳态的弛豫时间，通俗的说就是样品的寿命。但在光路上基本与稳态荧光是一致的。

根据样品本身的不同特性其寿命分布可以从飞秒，皮秒，纳秒，甚至到微秒量级。同时，针对不同的样品寿命，测试方法也会随之改变， 相对应的测试方法有荧光上转换（Up-conversion），时间相关单光子计数（Time-Correlated Single Photon Counting），多通道扫描（Multiple Channel Scan）等。这也是有别于TCSPC需要大量重复从能得到衰减曲线的重要特征。

2 瞬态荧光的获取方法：

荧光上转换（Up-conversion）

测试范围由fS-nS，光路核心部件光延迟线， 提供fs 量级的时间延迟，为系统测试提供时间精度保障。经过延迟线延迟的fs 脉冲与经过倍频fs 激光激发样品后产生的荧光进入混频器，产生波长大于样品荧光的的混频光。

样品的荧光寿命衰减曲线的时间轴由光延迟光路保证（分辨率和扫描宽度），而荧光强度由混频器后面的数据采集系统提供。这样的设计，将传统意义对快速探测器、高速电路的在时间响应和分辨率上的要求转而由相对容易实现光路延迟来完成（1ns 光程=0.3m，1ps 光程=0.3mm）， 而百微米的机械移动实现起来相对容易很多；***artFluo-QY的配套软件以数据为中心设计，用户只需要关注实验操作流程，软件将协助完成大部分数据采集与分析工作。从而轻松达到ps，甚至十几fs 的时间分辨率。

时间相关单光子计数（Time-Correlated Single Photon Counting）

时间相关单光子计数（TCSPC）实现了从百pS-nS-uS 的瞬态测试，相对于荧光上转换的测试方法，TCSPC 对数据的获取完全依赖快速探测器和高速电路。其实验构想非常便于理解：用统计的方法计算样品受激后发出的一个（也是一个）光子与激发光之间的时间差，也就是上图的Tstart（激发时刻）与Tstop（发光时刻）的时间差。 由于对于Stop 信号的要求，所以TCSPC 一般需要高重复频率的光源作为激发源，其重复至少要在KHz 以上，多数的光源都会达到MHz 量级；同时，在一般情况下还要对Stop 信号做数量上的控制；MiniPL为模块化设计、计算机自动控制的高灵敏度、宽带隙小型PL（光致荧光）光谱仪。尽量满足在一个激发周期内，样品产生且只产生一个光子的有效荧光信号，避免光子对的出现。多通道扫描（Multiple Channel Scan）

多通道（MCS）扫描主要测试由nS，uS，mS甚至延伸至S量级的测试方法。在测试， MCS 设备同时打开多个时间通道，在理论上存在Single Shot 即获得一条衰减曲线的可能；蒽的稳态光谱蒽的时间分辨的光谱虽然时间分辨中的每条瞬态光谱的波长分辨率只有10nm，但在380nm，400nm，420nm,450nm几处特征峰还是能清楚的说明了，荧光随着时间在同时淬灭，稳态与瞬态光谱的基本形貌，相对强度对比没有本质变化。这也是有别于TCSPC 需要大量重复从能得到衰减曲线的重要特征。相对于TCSPC，MCS 对光源的重复频率几乎没有特殊的要求，只要满足样品寿命的采集周期即可。

一般多使用低重频脉冲光源激发样品，依据激发源的强弱、样品本身的效率， 以及探测器的工作模式，基本可以得到两种种不同的同步输出- 连续和光子计数模式。随之采用不同的数据采集设备，对应连续模式输出的探测器，多用如示波器， 门宽积分器（BOXCAR）；一激发单线态或第二激发单线态等是不稳定的，所以会***基态，当电子由一激发单线态***到基态时，能量会以光的形式释放，即产生荧光。而对于光子计数模式输出的探测器则使用带门宽控制的光子计数器。

TCSPC 和MCS 都是针对特定的发射波长得到的荧光动力学衰减曲线，后续的数据处理主要是寿命拟合，得到样品在某个发射波长下的寿命。

相对于大多数的样品，其在不同发射波长下的寿命是相同，只是荧光的发光强弱有区别；OmniPL-MicroS组合式显微光致发光光谱系统显微光路通常具有较高的通光效率，用在荧光光谱测量中，不仅可以进一步提升系统的信噪比，更可以实现微区测量。从另一个方面解释，可以认为这种样品稳态光谱的形貌与瞬态光谱的形貌是一致的。瞬态光谱，一般是指某个时刻的荧光光谱，N 多条不同时段的瞬态光谱顺序排列就组合成了时间分辨的光谱。

但确实有一些样品其瞬态光谱的形貌是有别于稳态光谱的，这里面主要原因就是样品有某种可以相互传递能量的物质存在。以下两种样品分别为标样蒽，和一个客户的激光晶体样品，可以看出时间分辨光谱的意义。 TCSPC 和MCS 都是针对特定的发射波长得到的荧光动力学衰减曲线，后续的数据处理主要是寿命拟合，得到样品在某个发射波长下的寿命。相应的在衰减曲线的前端，可以看到一段非衰减曲线的存在，说明样品的不同物质之间存在着某种能量传递。

相对于大多数的样品，其在不同发射波长下的寿命是相同，只是荧光的发光强弱有区别；典型荧光光谱系统架构典型荧光光谱系统由如下几个部分构成：·激发光源。从另一个方面解释，可以认为这种样品稳态光谱的形貌与瞬态光谱的形貌是一致的。瞬态光谱，一般是指某个时刻的荧光光谱，N 多条不同时段的瞬态光谱顺序排列就组合成了时间分辨的光谱。

但确实有一些样品其瞬态光谱的形貌是有别于稳态光谱的，这里面主要原因就是样品有某种可以相互传递能量的物质存在。以下两种样品分别为标样蒽，和一个客户的激光晶体样品，可以看出时间分辨光谱的意义。

蒽的 稳态光谱

蒽的 时间分辨的光谱

虽然时间分辨中的每条瞬态光谱的波长分辨率只有10nm，但在380nm，400nm，420nm,450nm 几处特征峰还是能清楚的说明了，荧光随着时间在同时淬灭，稳态与瞬态光谱的基本形貌，相对强度对比没有本质变化。

激光晶体稳态发射光谱

各波长的衰减曲线

时间分辨的光谱

这是一个很好的例子，可以看到几个特征峰470nm，540nm，600nm 在稳态光谱与瞬态光谱中的形貌是不同的，而且在时间分辨光谱中相对强度随着时间的变化而变化；可有效用于***与生化领域的抗原-抗应、生物细胞、蛋白质、酶等的测量。相应的在衰减曲线的前端，可以看到一段非衰减曲线的存在，说明样品的不同物质之间存在着某种能量传递。这是瞬态光谱有别于稳态光谱存在的重要意义。

3 时间分辨荧光光谱：

前面所有数据都是来自有动力学衰减曲线。如果用这样的方法，在实际测试中为了得到时间分辨的光谱，都会以时间为代价。

那么有没有直接可以获得时间分辨光谱的设备呢？

答案是肯定的，那就是ICCD，条纹相机等设备。但必须说明，ICCD 和条纹相机的局限在于，它们获得了光谱，但要拟合某个特征波长的寿命，需要类似时间切份的反向数据处理。

以下简要介绍ICCD（Intensified CCD）

简单说就是在CCD 前面加了增强器，这个增强器不但可以倍增信号，更重要的是可以做门宽控制，可以只让一段很短的光信号入射到CCD 面上，从而获得相对于触发时刻的某一段时间的光谱。同时，门宽信号在同步扫描过样品发光的过程中，得到了不同时刻的瞬态光谱， 顺序排列后就是时间分辨的光谱。ICCD 获取TRES 的速度要远远快于TCSPC 的采集速度，但其时间分辨率没有前者好。OmniPL系列稳态荧光光谱测量系统采用模块化设计，在满足PL光谱测量的同时，用户可以根据不同的实验需求，选择不同的配件，灵活的进行系统功能的扩展。