点突变设计引物时是两条引物完全互补好还是不完

1、引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。上下游引物的互补性：一个引物的3‘末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上。

2、PCR的引物不是要求完全互补，只要3‘端能配对十几个碱基就能发生反应，而且在***个循环完成后，由上游引物扩增出来的链会和下游引物结合，把你修饰的位点也进行了扩增。希望对你有帮助。

3、引物设计有 3 条基本原则：引物与模板的序列要紧密互补。引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构。再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。

4、引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。

5、所设计的寡核苷酸引物在所扩增的目的片段一端引入点突变，PCR扩增后获得两条PCR产物，先将两条均含有突变的片段退火形成新的模板，然后由互补的引物引导延伸合成含有突变位点的全长片段。

******中有关点突变引物设计问题

1、告诉你一个网站，http：//frodo.wi.mit.edu/primer3/，在线设计引物，网站里面提到的变量就是你要注意的地方。

2、第二是看插入的方向和位置是否正确。如果做定量PCR用到质粒的话，一般是用来做标准曲线的。 聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看。

3、注意事项有三大点。引物***好在模板 cDNA 的保守区内设计。DNA 序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。

4、碱基发生不互补的时候需要考虑该碱基所在位置，一般来说越靠近3-端，引物与模板的匹配难度越大，容易降低扩增效率。但是靠近5-端时影响会减小。

5、退火温度越高，引物特异性越好。就是退火温度越高，要求引物与模板的匹配度就越高。***定点突变的引物，只有1个或几个碱基突变，在此情况下，退火温度高，才能将其他非特异结合的情况给排除掉。不过，不一定要78°吧。

定点突变是怎么通过PCR作用达到目的的

PCR技术广泛用于定点突变，如果变异部位位于***的末端，只要在5端或3端引物设计时引入变异碱基，便可使目的***的PCR产物发生变异。

将两个片段的回收产物混合，用重叠PCR扩增得到全长。这样就通过在中间引物上设计突变的方式达到定点突变。采用重叠引物PCR介导的定点突变实验是一种快速有效的在***中特***点引入特定突变的有效技术。

定点突变技术，在pcr的时候把引物的某一个核苷酸换成需要的突变核苷酸，pcr之后的产物就是在人为突变引物的后面续接而成的，就可以得到突变的目的dna。

通过多聚酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段中引入所需变化（通常是有利的），包括碱基对的增添、缺失和替换等。定点突变能迅速，***地改变DNA所表达的目的蛋白，从而影响生物性状，是***研究工作中一种非常有用的手段。

定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是***组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。

采用重叠引物PCR介导的定点突变实验是一种快速有效的在***中特***点引入特定突变的有效技术。