***鞣素操作步骤试管法（改良Mayer法）1、致敏羊红细胞：2%绵羊红细胞加等量稀释后的溶血素（1:2000），混匀，置37℃水浴30min。2、稀释***：待测***0.2ml，加应用液3.8ml，稀释度为1:20。3、配制溶血标准管：全溶血管:2%绵羊红细胞2ml加8ml蒸馏水，混匀。50%溶血管:取全溶血管液2ml加缓冲液2ml。4、按表所示，依次加各成分于试管中，混匀，置37℃水浴30min，第10管为非溶血对照：补体CH50测定试管法5、结果测定：取出试管，2000r/min离心10min，对照管应不溶血。肉眼比色，选与50%溶血标准管相近二管，再用分光光度计测（波长542nm、0.5cm比色杯）OD值，确定与标准管***接近者为终点管，然后按下公式计算CH50值：***补体CH50（U/ml）=（1/***用量）×稀释度。如第5管为终点管，测待测***中CH50为66.7U/ml。***补体CH50正常值为50-100U/ml。***鞣素标本要求1.***：室温血液自然凝固10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成应再次离心。3.尿液：用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸***、脑脊液参照此实行。4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。5.培养细胞:检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融或加入***蛋白萃取***，以使细胞***并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。6.***标本:切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），或***蛋白萃取***,用手工或匀浆器将标本匀浆化。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。7.标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融8.不能检测含NaN3的样品，因NaN3***辣根过氧化物酶的（HRP）活性。***鞣素试验操作中可能影响结果的原因及其相应的解决办法1选择***选择质量优良的检测***，严格按照***说明书进行操作，操作前将***在室温下平衡至少30分钟。2加样可能原因：1）***或血浆标本分离不好即进行加样；2）手工操作中，加样板过多造成加样后放入孵箱前等待时间过长(特别是室内温度较高时)；3）加完标本再加酶***时酶溅出孔外。解决办法：1）标本为***：将血液先自然存放1-2小时后，再用3000rmp离心15分钟；标本为血浆：必须使用含抗凝剂的血液标本收集管，采血后必须立即颠倒采血管混合5-10次，放置一段时间后，3000rpm离心15分钟；若在几天内检测，可放在2-8℃冰箱中，若要贮存，则置于-20℃的低温冰箱内。2)加样后及时放入孵箱。3)加酶***后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。4)如果采用AT或其他全自动加样，***好选择FAME或其他后处理仪器加酶***。5)标本较多时，请分批操作。3孵育可能原因：1)孵育时未贴封片或加盖，使标本或稀释液蒸发，吸附于孔壁，难于清洗彻底；2)孵育时间人为延长，导致非特异性结合紧附于反应孔周围，难以清洗彻底。解决办法：1)贴封片或加盖；2)按说明步骤严格控制操作时间。4洗板可能原因：1)采用手工洗板,孔与孔之间液体交叉。2)采用半自动***洗板时，洗液量不足，导致洗板不彻底；洗板针堵塞，抽吸不完全；洗板不畅，导致洗板效果差。3)反应板过多造成洗板等待时间长。解决办法：1)保证洗液注满各孔，洗板针畅通，洗完板后***好在吸水纸（选择干净、无或少尘的吸水材料）上轻轻拍干；2)合理安排，或多用几台***。5显色可能原因：1)显色剂配制后放置时间过长或使用过期显色剂；2)加显色剂时溅出孔外造成液体回流。解决办法：1)显色剂尽量在临用前配制，坚持不用过期显色剂，肉眼可见浅蓝色的TMB显色剂不用；2)加样时保持显色剂不外流；3)A、B液应避免接触金属器械。6终止可能原因如加终止液时产生较多气泡，导致假阳性增加。所以在加终止液时应避免产生气泡。7读板如读板时板底不清洁等。应保证酶标板清洁。在整个操作过程中保证酶标板不接触次氯酸；尽可能实现ELISA检测标准自动化，有效提高检测质量。在实际操作中，除了选择优良***外，必须严格按照操作步骤进行操作，同时做好室内质控、室间质评，以严谨的工作作风检测每一份标本，才能保证检测质量。温馨提示：不可用于临床***。)