澳洲茄碱注：1.用户在初次使用***盒时，应将各种***管离心数分钟，以便***集中到管底。2.每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何***，只是***后加底物溶液及2NH2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。3.为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜。4.未使用完的酶标板或者***，请于2-8℃保存。标准品、生物素标记***工作液、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液请依据所需的量配置使用。请勿重复使用已稀释过的标准品、生物素标记***工作液或、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液。5.建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。洗板方法手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内，浸泡1-2分钟。根据需要，重复此过程数次。自动洗板：如果有自动***，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。计算以标准物的浓度为横坐标（对数坐标），OD值为纵坐标（普通坐标），在半对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。澳洲茄碱标本的采集及保存1.***：全血标本请于室温放置2小时或4℃过一晚后于1000xg离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。2.血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2-8°C1000xg离心15分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。3.细胞培养物上清或其它生物标本：1000xg离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。注：标本溶血会影响***后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。标本的稀释原则：首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量，确定适当的稀释倍数。只有稀释至标准曲线的范围内，检测的结果才是准确的。稀释的过程中，应做好详细的记录。***后计算浓度时，稀释了“N”倍，标本的浓度应再乘以“N”。标准品的稀释原则：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为300pg/ml，做系列倍比稀释后，分别稀释300pg/ml，150pg/ml，75pg/ml，37.5pg/ml，18.5pg/ml，9pg/ml，4.5pg/ml，样品稀释液直接作为标准浓度0pg/ml，临用前15分钟内配制。如配制150pg/ml标准品：取0.5ml（不要少于0.5ml）300pg/ml的上述标准品加入含0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。生物素标记***的稀释原则：临用前以生物素标记***稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100μl），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl生物素标记***加990μl生物素标记***稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。辣根过氧化物酶标记亲和素的稀释原则：临用前以辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100μl），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根过氧化物酶标记亲和素加990μl辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。澳洲茄碱常用标签包括有Flag、myc、HA、His、GST、GFP、MBP等。Flag标签系统利用一个短的亲水性八氨基酸肽（DYKDDDDK）融合到目标蛋白；其纯化条件是非变性的，因此可以纯化所有有活性的融合蛋白。His标签是由6个组氨酸（His-His-His-His-His-His）组成的短肽，专门设计用于重组蛋白的吸附纯化。由于分子量小，且较容易分离和纯化，是目前使用***广泛的一种。GST标签体系具有蛋白表达率高，表达产物纯化方便，利于GST***制备的特点。GST融合蛋白在水溶液中可溶，可从***裂解液中提取，在不变性的条件下通过亲和层析得到。GFP或其突变体EGFP等广泛用于***表达效率的检测，以及和目的蛋白融合表达用于检测目的蛋白的表达和分别。GFP***不经可以检测GFP或其适当的突变体，也可以检测和GFP或其适当的突变体融合表达蛋白的表达、细胞内***，以及纯化、定性或定量检测GFP融合表达蛋白等。Myc标签（序列为：EQKLISEEDL）已成功应用于WB杂交技术、***沉淀IP和流式细胞术中。因此可用于检测重组蛋白在***、酵母、昆虫细胞和哺乳细胞中的表达情况。Myc重组蛋白质可通过偶联Myc标签***到活化的琼脂糖上而进行亲和纯化。但Myc重组蛋白的低pH洗脱条件往往会降低蛋白质的活力，因此Myc标签系统广泛应用于检测但很少用于纯化。HA标签系统利用一个HA（influenzahemagglutintinepitope:YPYDVPDYA）短肽融合到目标蛋白。HA标签可位于蛋白质的C端或N端，该系统已广泛应用于多种细胞类型，相应的HA标签***也被广泛运用。MBP标签蛋白大小为40kDa，由大肠***K12的malE***编码。MBP可增加在***中过量表达的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。如果蛋白在***中表达，MBP可以融合在蛋白的N端或C端。可用MBP***或表达的目的蛋白特异性***检测MBP标签标记的重组蛋白。其余标签***还有V5、GFP、RFP、β-Actin、β-Tubulin、GAPDH、ERK1、AU1、***i、B、CBP、DDDDK、E、E2、Glu-Glu、HAT、HP***、HSV、KT3、KLH、MAT、ProteinA、S、S1、SNAP、SRT、NWSHPQFEK、SUMO、T7、Tag-100、TAP、Trx、Ty1、TF、Universal、VSV-G等，但应用相对较少。温馨提示：不可用于临床***。)