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RPA原理重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物,能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物***了同源序列,就会发生链交换反应形成并启动DNA合成,对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合,防止进一步替换。在这个体系中,由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快,一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。恒温扩增技术应用领域:广泛应用于临床诊断,食品安全检测,动物***检测等领域技术特点:快速,特异,无需专门设备类型:取代PCR的恒温核酸扩增技术,目前有应用前景的就是RPA技术,此外也有一些其他恒温扩增技术,主要包括:1.滚环核酸扩增(rollingcircleamolification,RCA)2.环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)3.链替代扩增4.依赖核酸序列扩增(nucleicacidsequencebasedamplification,NASBA)5.解链酶扩增(helixdependentamplification,HAD)RPA与LAMP对比LAMP:环介导等温扩增法的特征是针对目标DNA链上的六个区段设计四个不同的引物然后再利用链置换反应在一定温度下进行反应。反应只需要把***模板、引物、链置换型DNA合成酶、基质等共同置于一定温度下(60~65℃)、经一个步骤即可完成。RPA:主要依赖于三种酶:能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物,能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物***了同源序列,就会发生链交换反应形成并启动DNA合成,对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合,防止进一步替换。在这个体系中,由两个相对的引物起始一个合成事件。RPA技术犀利在何处常规PCR必须经过变性、退火、延伸三个步骤,而PCR仪本质上就是一个控制温度升降的设备。RPA反应的温度在37°C-42°C之间,无需变性,在常温下即可进行。这无疑能大大加快PCR的速度。此外,由于不需要温控设备,RPA可以真正实现便携式的快速核酸检测。据介绍,RPA检测的灵敏度很高,能够将痕量的核酸(尤其是DNA)模板扩增到可以检出的水平,从单个模板分子得到大约1012扩增产物。而且RPA还用不着复杂的样品处理,适用于无法提取核酸的实地检测。)
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