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液氮法主要操作步骤为:(1)选择处于对数生长期的细胞,在冻存前一天尤好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉,用025%胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶,加入少量新培养液。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞,使其成为均匀分敞的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处理。然后将细胞收集于高心管中离心(1000r/min,10分钟)。(4)将装好细胞的安瓿或冻存管装入沙布袋内;置于液氮容器颈口处存放过夜,次日转入液氮中。采用控制降温速度的方法也可采用下列步骤:先将安瓿置入4C冰箱中2~3小时,再移至冰箱冷冻室内3~4小时(此步可省略),再吊入液氮容器颈气态部分存放2小时,之后沉入液氮中。分布降温法:细胞系冻存程序:1)单层细胞的消化。将经24~48小时培养已长成单层的传代细胞培养物弃去生长液,加适量ATV,1~2分钟后倒弃ATV,再加入少量ATV液,经0.5~1分钟倒去ATV,室温或37oC温箱作用2~3分钟,视细胞解离情况,拍打细胞培养瓶。使单层细胞完全解离。SP2/0瘤细胞,待生长好后用吸管吹打,再经1000转1分离心10分钟。低温保护剂的应用:在细胞冻存时加入温保护剂,能大大提高冻存效果。常用的低温保护剂是DMSO,它是一种渗透性保护剂,可迅速透入细胞,提高胞膜对水的通透性,降低冰点,延缓过程,能使细胞内水分在冻l结前透出细胞外,在胞外形成冰晶,减少胞内冰晶,从而减少冰晶对细胞的损伤。细胞冻存方法:预先配制冻存液:含20%血l清培养基;10%DMSO;取对数生长期细胞,经胰酶消化后,加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液(1~5X10细胞/ml);加入1ml细胞于冻存管中,密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。细胞复苏方法:(1)从液氮中取出冷冻管,迅速投入37~38C水浴中,使其融化(1min左右)。(2)5min内用培养液稀释至原体积的10倍以上。(3)低速离心10min。(4)去上清,加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。)
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