反相色谱影响因素(1)柱长有机小分子和肽类的分辨率随柱长的增加而增加．但是柱长增加并不能使蛋白质和核酸等生物大分子的分辨率显著增加．它们在较短的柱子上往往也有很好的分离效果。(2)流动相的流速。以前填料纯化技术不是很成熟，十八***键合到硅胶表面不是很完全，硅胶上总是少量的硅羟基在外面。有机小分子和肽类的分辨率对流动相流速非常敏感。而蛋白质和核酸等生物大分子的分辨率则不然。流速越小，柱子越长，色谱峰的宽度就越大，分辨率就越小。制备色谱上样过程中的流速对动态吸附容量影响很大。(3)温度。温度上升，流动相黏度下降，流动速度加快，且流动相与固定相之间的传质速度加快，使分辨率增加。同时，温度上升，分子热运动增加，疏水性作用减弱。升高温度要考虑目标物质的热稳定性。(4)流动相组成。流动相的极性越大，溶质的分配系数越大，洗脱时间越长。RPC多采用降低流动相极性(水含量)的线性梯度洗脱法。水是极性强的溶剂，在反相色谱中常常和基础溶剂配合使用，向流动相中加入不同浓度的、可以与水混溶的有机溶1剂，以得到不同强度的流动相，这些有机溶1剂称为修饰剂。反相色谱中的有机溶1剂。此外，乙醇、四氢呋1喃、异丙1醇及二氧六环也常被用作修饰剂。有机溶1剂梯度的大小也会影响分辨率，一般梯度越小，分辨率越大。如果流路管中真漏气了怎么办？建议是用外力使管路中充满液体。具体如下：1、找到流路管进入输送泵的接头。2、拧下来。3、用一干净洗耳球的尖1端对准管路的平整切口。4、吸液体，看液面从流动相瓶里上升，至离洗耳球5cm左右时停止该动作。5、快速把接头拧回输送泵上（这个过程可能会有少许流动相外泄，这是正常现象）。6、开机，开排液阀门，启动输送泵。7、等排液管中流出的溶液没有气泡时，再关闭排液阀，仪器正常工作。输送泵和柱子：这些部分进了气泡一般不怕，冲掉就行。液相色谱系统提高了HPLC的分离度、灵敏度、速度、精度和可靠性；***的并联泵头及单向阀设计理念，融合了当今世界上***的制造应用经验，使得用户在各种使用条件下都可以保证输液的精度、脉动等性能指标，具备小系统死体积，工作能力可获得的提高。填料一般使用软质的葡聚糖、琼脂糖、纤维素、合成高聚物或离子交换剂，粒径一般为40-60μm。液相色谱系统的原理就是利用待分离的各种物质在两相中的分配系数、吸附能力等亲和能力的不同来进行分离的。使用外力使含有样品的流动相（气体、液体）通过一固定于柱中或平板上、与流动相互不相溶的固定相表面。当流动相中携带的混合物流经固定相时，混合物中的各组分与固定相发生相互作用。如何预防液相色谱仪液相泵的故障：要保持泵的良好操作性能，必须维护系统的清洁，保证溶剂和***的质量，对流动相进行过滤和脱气.下面列出预防泵故障的几项措施：1、用高质量***和HPLC级溶剂；2、过滤流动相和溶剂；3、脱气；4、每天开始使用时放空排气，工作结束后从泵中洗去缓冲液；5、不让水或腐蚀性溶剂滞留泵中；6、定期更换垫圈；7、需要时加润滑油；8、查阅有关泵操作手册中的其它建议。处于良好操作状态的泵，应该能使色谱图上的基线平稳；保留时间的重复性好。措施：对于污染用不同极性的一系列溶剂冲洗有可能解决问题，如用25mL水依次冲洗。在等度洗脱时压力波动小于2%。梯度洗脱时压力变化应是缓慢和平稳的。为了使故障发生后尽除，平时应常备密封、单向阀、泵头装置、各式接头、***丝等部件，以及更换工具。)