反相色谱中样品的保留值主要由固定相比表面积、键合相种类和浓度决定，保留值通常随链长增长或键合相的疏水性增强而增大．对于非极性化合物通常遵循以下规则：(弱)非键合硅胶《基lt;C1(TMS)lt;C3lt;***lt;lt;C8≈C18(强)。溶质保留值与固定相表面积成正比，普通载体(80A°)的比表面积约为250m2/g，而300A°孔径载体的比表面积约为60m2/g。当其他条件相同时，溶质在300A°孔径(低表面积)色谱柱上的保留值大约为80A°孔径色谱柱上保留值的1/4(60：250)，小孔隙柱如高保留的C18柱或石墨柱有利于强亲水性样品洗脱。样品的保留值也可以通过改变流动相组成或溶剂强度来调整，溶剂强度取决于的性质和其在流动相中的浓度。在反相色谱中，采用高溶剂强度、低极性的流动相时可获得较低的保留值。固定相的不同也可以导致选择性发生变化，基柱、柱、C8柱、C18柱等的选择性有很大差异，一般应优先考虑C8柱、C18柱，然后是基柱，再次是柱。据统计，近80%的有机物及无机物可以用液相色谱法进行分离．其中反相色谱中的C18柱是液相色谱中为常用的一类色谱柱。但是从我们长期使用的实际效果来说，只要能保证水的质量，这一步完全可以也应当去除。色谱又称色层法或层析法，是一种物理化学分析方法，它利用不同溶质（样品）与固定相和流动相之间的作用力（分配、吸附、离子交换等）的差别，当两相做相对移动时，各溶质在两相间进行多次平衡，使各溶质达到相互分离。1906年Tswett研究植物色素分离时提出色谱法概念；他在研究植物叶的色素成分时，将植色谱物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后加入使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。按光谱的命名方式，这种方法因此得名为色谱法。以后此法逐渐应用于无色物质的分离，“色谱”二字虽已失去原来的含义，但仍被人们沿用至今。在色谱法中，静止不动的一相（固体或液体）称为固定相（stationaryphase）；分配色谱是利用溶液中被分离物质在两相中分配系数不同，以使组分分离。运动的一相（一般是气体或液体）称为流动相（mobilephase）。色谱分析法、层析法，是一种分离和分析方法，现代生物企业生产过程中的核心技术之一。在分析化学、有机化学、生***学等领域有着非常广泛的应用。色谱法利用不同物质在不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，终达到分离的效果。色谱理论：保留时间保留时间是样品从进入色谱柱到流出色谱柱所需要的时间，不同的物质在不同的色谱柱上以不同的流动相洗脱会有不同的保留时间，因此保留时间是色谱分析法比较重要的参数之一。保留时间由物质在色谱中的分配系数决定：tR=t0(1KVs/Vm)式中tR表示某物质的保留时间，t0是色谱系统的死时间，即流动相进入色谱柱到流出色谱柱的时间，这个时间由色谱柱的孔隙、流动相的流速等因素决定。K为分配系数，VsVm表示固定相和流动相的体积。这个公式又叫做色谱过程方程，是色谱学基本的公式之一。质谱连用技术受到普遍重视，如分析氨基甲酸酯和多核芳烃等，液相色谱仪连用也发展很快，如在环境污染分析测定水中的烃类，海水中的不挥发烃类，使环境污染分析得到新的发展。液相色谱仪的常规操作及维修：1、过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。2、对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。3、打开HPLC工作站，连接好流动相管道，连接检测系统。4、进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。5、有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10ml/min。6、调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。7、设计走样方法。点击file，选取se-lectusersandmethods，可以选有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击newmethod。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a、进样前的稳流，一般2-5分钟；b、基线归零；c、进样阀的loading-inject转换；因为不紧密的安装，不仅会引起装置的泄漏，而且有可能对色谱柱造成损坏。d、走样时间，随不同的样品而不同。8、进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击trun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。9、关机时，先关计算机，再关液相色谱。)