反相色谱影响因素(1)柱长有机小分子和肽类的分辨率随柱长的增加而增加．但是柱长增加并不能使蛋白质和核酸等生物大分子的分辨率显著增加．它们在较短的柱子上往往也有很好的分离效果。(2)流动相的流速。有机小分子和肽类的分辨率对流动相流速非常敏感。在安装时要将色谱柱的两端截去一部分，保证没有进样垫的碎屑残留于柱中。而蛋白质和核酸等生物大分子的分辨率则不然。流速越小，柱子越长，色谱峰的宽度就越大，分辨率就越小。制备色谱上样过程中的流速对动态吸附容量影响很大。(3)温度。温度上升，流动相黏度下降，流动速度加快，且流动相与固定相之间的传质速度加快，使分辨率增加。同时，温度上升，分子热运动增加，疏水性作用减弱。升高温度要考虑目标物质的热稳定性。(4)流动相组成。流动相的极性越大，溶质的分配系数越大，洗脱时间越长。RPC多采用降低流动相极性(水含量)的线性梯度洗脱法。水是极性强的溶剂，在反相色谱中常常和基础溶剂配合使用，向流动相中加入不同浓度的、可以与水混溶的有机溶1剂，以得到不同强度的流动相，这些有机溶1剂称为修饰剂。反相色谱中的有机溶1剂。此外，乙醇、四氢呋1喃、异丙1醇及二氧六环也常被用作修饰剂。有机溶1剂梯度的大小也会影响分辨率，一般梯度越小，分辨率越大。如果流路管中真漏气了怎么办？建议是用外力使管路中充满液体。具体如下：1、找到流路管进入输送泵的接头。2、拧下来。3、用一干净洗耳球的尖1端对准管路的平整切口。4、吸液体，看液面从流动相瓶里上升，至离洗耳球5cm左右时停止该动作。5、快速把接头拧回输送泵上（这个过程可能会有少许流动相外泄，这是正常现象）。6、开机，开排液阀门，启动输送泵。7、等排液管中流出的溶液没有气泡时，再关闭排液阀，仪器正常工作。输送泵和柱子：这些部分进了气泡一般不怕，冲掉就行。液相色谱仪是一种非常***的分析仪器，气主要采用液相色谱法，是一种使用液体当做流动相的色谱仪器，在当今涉及到多个行业领域，液相色谱仪应用范围非常广。液相色谱仪是色谱仪器之一，刚才我们也说到了，它是亿液体为流动相进行分析。色谱分析法、层析法，是一种分离和分析方法，现代生物企业生产过程中的核心技术之一。液相色谱仪采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。它的主要特点有高速、高压、高灵敏度，液相色谱仪比传统的液相色谱仪速度要快、灵敏度也高、色谱柱可以反复使用、分辨率高等等，所以现在很多都选择液相色谱仪。液相色谱仪的应用范围非常广，现在涉及多个领域，已成为化学、***、工业、农学、商检和法检等科学科领域中重要的分离分析技术。液相色谱系统的结构及功能说明：液相色谱系统一般由溶剂输送系统、进样系统、分离系统（色谱柱）、检测系统和数据处理与记录系统组成，具体包括储液器、输液泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪或数据工作站等几部分。其中输液泵、色谱柱和检测器是HPLC仪的关键部分。按一般液相柱的正常使用寿命计算，过滤片的成本会远远高于色谱柱的成本上升。1、溶剂输送系统：储液器：用来贮存数量足够、符合要求的流动相。配有溶剂过滤器，以防止流动相中的颗粒进入泵内。脱气器：脱气的目的是为了防止流动相从色谱柱内流出时释放出气泡进入检测器，从而引起噪声，不能正常检测。输液泵：将储液器中的流动相连续不断地以高压形式进入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。梯度洗脱装置：是在分离过程中通过逐渐改变流动相的组成增加洗脱能力的一种装置。2、进样系统：进样器：是将样品送入色谱柱的装置，进样方式可以分为两种：阀进样或自动进样。比较常用的是采用自动进样器装样。3、分离系统：色谱柱：对样品进行分离，是整个色谱系统的心脏，它的质量优劣直接影响到分离的效果。4、检测系统：检测器：将色谱柱连续流出的样品组分转变成易于测量的电信号，被数据系统接收，得到样品分离的色谱图。5、数据处理和记录系统：对色谱数据进行处理，并参与HPLC仪器的自动控制。)