RNA提取1.弃去培养液，用PBS清洗两次1-2。2.弃去PBS，用1000u1吸干净残余PBS。3.加1mlTRIZOL研磨B41。4.1.5mIEP管标号与每孔相对应备用。5.研磨好的溶液转移至对应的EP管中国。6.往每个EP管中加入250ul，剧烈震荡30s，冰上静置12min[问l。7.所有样品4C离心，转速:13500转1分钟，云南pcr，时间:15min.8.再次标记一批同样编号EP管。9.离心后吸上清液400u1移入相应编号的EP管中，再加入400ul异充分混匀。4C冰箱35min。10.4C离心，转速:13500转1分钟，时间:10min.11.弃去.上清液，fish检测，加1m175%乙醇，轻摇7]。12.4C离心，10600转/分钟，时间:5min.13.弃上清液滤纸吸干。14.加DEPC水10ul溶解，-80C保存。进行逆转录前测浓度。***RNA提取1、剪米粒大小***块放入EP管中标号。2、EP管中加300ultrizol浸泡30分钟或更久。3、用研磨棒研磨，以肉眼很难看到***为宜。4、加700u1trizol静置5分钟。二、操作步骤：1.所有在纯化系统里使用的溶液当日都需要经过0.22μm的滤膜抽滤、脱气处理；保存4℃冰箱里的缓冲液若要在室温使用需***至室温后抽滤脱气；2.样品上柱纯化前，需先滤膜过滤，实时荧光定量pcr，少量样品可用离心（13000rpm，10min）；3.依次用水、缓冲液洗泵；设置流速和柱前警报压（压力值参阅层析柱及填料说明书，取较小的一个大耐受压力）。防止柱中进入气泡，影响分离效果；4.当柱子限压在0.3MPa，或者在限压状态下流速很低时，pHvalve中的Restirtor可以切换成Offline，即显示By-pass状态；5.当需要通过仪器上样环上样时，将W1阀口处换成带透明短软管的阀门，从此处阀门位通过倒吸样品上样；6.进样阀「Inject」为上样状态。上样结束可将进样阀切换回「Load」状态。并用纯水认真清洗上样环至少3次；将W1阀口处换回原来接头阀门。7.纯化结束后，用纯水清洗泵和平衡柱子；再用20%的乙醇清洗泵以及系统。长期不用，层析柱应保存在20%的乙醇中，泵放置在20%乙醇中；8.实验结束后及时倾倒废液瓶里的废液；16.长链引物为什么出错的几率非常高？答：引物合成时，每一步反应效率都不能达到100%，产生碱基插入、缺失、置换突变的因素客观条件都有一直存在。引物链越长，突变的频率累加起来就越高。研究人员总希望合成的引物万无一失，这种心情可以理解。但是犹如PCR扩增，不可能保证扩增产物中没有突变，引物合成也不可能保证100%正确。要知道，引物合成中发生错误（非人为因素）的频率，比任何高保真高温聚合酶PCR扩增过程所产生的频率都要高。做引物合成，长链引物合成，您要有引物中部分引物可能有突变的思想准备。17.如果测序发现突变，该如何处理？答：遇到这种情况，首先和核酸合成厂家取得联系，生产人员会检查生产的原始记录，荧光定量pcr，主要是核对合成序列是否和定单一致，他们在电脑中一般会保留所有原始数据。在确认引物合成序列没有输错的情况下，建议重新挑取测序，可能会找到正确的。根据经验，40个碱基以下的引物，测1-2个就可以了；40个以上的特别是用于全片段拼接合成的，就需要多测一些了。一般情况下，每个突变的位点都不一样，提示正确的总是有的，就是如何找到它。也可以要求公司将引物免费重合一次，不过重合的引物和次的引物一样，都可能含突变，不会因为重合的引物就减少您的遇到问题的几率。***拼接过程中，如果发现一段区域突变点不多，就多测几个，否则就重合一下引物。南京英瀚斯生物科技(图)-fish检测-云南pcr由南京英瀚斯生物科技有限公司提供。南京英瀚斯生物科技有限公司坚持“以人为本”的企业理念，拥有一支高素质的员工***，力求提供更好的产品和服务回馈社会，并欢迎广大新老客户光临惠顾，真诚合作、共创美好未来。英瀚斯——您可信赖的朋友，公司地址：江苏省南京市栖霞区和燕路371号东南大学***大学科技园科创楼A301，联系人：戴经理。)