miRNA测序microRNA(miRNA)是一种大小约21—23个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（双链）但是和siRNA密切相关。microRNA通过和靶***mRNA碱基配对引导沉默复合体（RISC）降解mRNA或***mRNA的翻译，从而在转录后水平调控蛋白表达（新发现miRNA也能在转录水平调控***表达）。miRNA在物种进化中相当保守，在动物、植物和***等中发现的miRNA表达均有严格的***特异性和时序性。miRNA在细胞生长和发育过程中起多种作用，包括调控发育、分化、凋亡和增殖等。目前研究miRNA的方法主要是realtime-PCR、生物芯片技术以及第二代测序技术。基于第二代测序技术的miRNA测序，可以一次获得数百万条miRNA序列，能够快速鉴定出不同***、不同发育阶段、不同***状态下已知和未知的miRNA及其表达差异，为研究miRNA对细胞进程的作用及其生物学影响提供了有力工具。动物***细胞***组DNA提取操作步骤1.取新鲜或冰冻动物***块0.1g（0.5cm3），尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，实时荧光定量pcr，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见***块，转入1.5ml离心管中，加入蛋白酶K（500ug/ml）20μl，fish检测，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。2.加2倍体积异，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100ul吸头挑出，dna检测，凉干，用200ulTE重新溶解。（可进行PCR反应等，需要进一步纯化的按下列步骤进行）3.加等量的酚??振荡混匀，离心12000rpm，5min。4.取上层溶液至另一管，加入等体积的?，振荡混匀，离心12000rpm，5min。5.取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5mol/L氨加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀2min，离心12000rpm，10min。6.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。7.用1ml70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000rpm，5min。8.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，宿迁pcr，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。9.加200ulTE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?C20℃保存备用。10.吸取适量样品于GeneQuant上检测浓度和纯度。蛋白质双向电泳实验流程1.三氯yi酸-bing酮沉淀法提取蛋白2.双向电泳分离待测样品(1)一相等电聚焦前处理按照所用仪器的厂商提供操作手册进行。蛋白质上样浓度不要超过10mg/mL，否则会造成蛋白质的聚集或沉淀。(2)等电聚焦完毕后(约需24hr），若不立即进行第二相电泳，胶条可夹在两层塑料薄膜中于-70℃保存数月。(3)等电聚焦好的胶条按厂商提供的操作手册平衡两次。平衡完毕后，于电泳仪上用12.5%SDS-PAGE凝胶进行电泳分离。仪器设置为2.5W/胶45min，15W/胶5-8hr，20℃。3.银染法对凝胶进行染色(1)固定(2)清洗(3)增敏(4)清洗(5)染色(6)清洗(7)显影(8)定影(9)水洗3.凝胶扫描及图像分析(1)图像扫描：凝胶染色后采用Imagescanner以300dpi，16-bit模式（65536灰阶）进行扫描。(2)图像分析：扫描完毕后，凝胶继续置于1%yi酸中于4℃保存。扫描后的图像用ImageMaster2DPlatinumsoftware软件进行分析。分析按照软件厂商提供的说明书进行。以***小点面积30，平滑度2为主要参数***大限度检测蛋白质点。以目标蛋白质3个重复具有相同趋势，目标蛋白质相邻位点的相对一致性，至少2个重复有2倍以上差异作为判定差异表达蛋白质的标准。实时荧光定量pcr-英瀚斯生物科技-宿迁pcr由南京英瀚斯生物科技有限公司提供。南京英瀚斯生物科技有限公司拥有很好的服务与产品，不断地受到新老用户及业内人士的肯定和信任。我们公司是商盟认证会员，点击页面的商盟***图标，可以直接与我们***人员对话，愿我们今后的合作愉快！)