22.同样的OD用PAGE检测，EB染色为什么深浅不一？答：通常可以用EB染色的方法来判断双链DNA的量(如质粒DNA)，因为EB可以嵌合到双链DNA中。而合成的单链DNA，由于碱基组成不同，形成二级结构的可能性不同，EB的染色程度也会有差异，比如Oligo(dT)等不形成二级结构，EB染色效果就非常差。所以不要用EB染色的方法来定量，而用紫外分光光度计检测。同样道理，用EB染色来照片不适合所有引物。23.引物不纯会有什么后果？答：引物不纯可能会导致：1)非特异性扩增；2)无法用预先设计在引物5′端酶切位点的酶切开，特别是没有保护碱基的引物；3)用于测序出现双峰或乱峰。解决办法重新合成或重新纯化。24.已经溶解的引物，***检测多少钱，为什么原先使用正常，而过一段时间再使用就不好了？答：如果溶解引物的水PH过低或污染了菌或核酸酶，会使引物降解。使用时没有充分解冻混合，液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。建议分装引物，避免反复冻溶。建议使用10mMTrispH7.5缓冲液溶解引物，因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5），引物在这种条件下不稳定。还有一种可能性是引物没有问题，而是PCR使用材料特别是模板的质量与先前使用的不完全一致。分子实验介绍——荧光定量PCR检测荧光定量PCR是检测生物样品中RNA含量的普遍的方法，通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。目前主要使用Sybrgreen和taqman法对RNA含量进行检测。Sybrgreen在低样本量时成本较低，目前选用的较多。SYBRGreenI是一种只与DNA双链结合的荧光染料。当它与DNA双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。SYBRGreen荧光染料法定量PCR的基本过程是：1、开始反应，当SYBRGreen染料与DNA双链结合时发出荧光。2、DNA变性时，pcr检测，SYBRGreen染料释放出来，荧光急剧减少。3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成PCR产物。4、聚合完成后，SYBRGreen染料与双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。实验流程：细胞或***RNA提取-RNA浓度检测-RNA逆转录-定量PCR检测。结果示例：图A***扩增曲线图；B***扩增溶解曲线图；CmRNA相对表达量变化从图中可以扩增曲线可以看出目的RNA扩增效果，溶解曲线可以看出引物识别特异性情况，通过使用ΔΔCt方法计算可以得到每个组中目的mRNA表达变化。RNA提取1.弃去培养液，用PBS清洗两次1-2。2.弃去PBS，用1000u1吸干净残余PBS。3.加1mlTRIZOL研磨B41。4.1.5mIEP管标号与每孔相对应备用。5.研磨好的溶液转移至对应的EP管中国。6.往每个EP管中加入250ul，剧烈震荡30s，冰上静置12min[问l。7.所有样品4C离心，转速:13500转1分钟，时间:15min.8.再次标记一批同样编号EP管。9.离心后吸上清液400u1移入相应编号的EP管中，再加入400ul异充分混匀。4C冰箱35min。10.4C离心，转速:13500转1分钟，时间:10min.11.弃去.上清液，实时荧光定量pcr，加1m175%乙醇，轻摇7]。12.4C离心，10600转/分钟，宿迁pcr，时间:5min.13.弃上清液滤纸吸干。14.加DEPC水10ul溶解，-80C保存。进行逆转录前测浓度。***RNA提取1、剪米粒大小***块放入EP管中标号。2、EP管中加300ultrizol浸泡30分钟或更久。3、用研磨棒研磨，以肉眼很难看到***为宜。4、加700u1trizol静置5分钟。pcr检测-英瀚斯生物科技-宿迁pcr由南京英瀚斯生物科技有限公司提供。行路致远，砥砺前行。南京英瀚斯生物科技有限公司致力成为与您共赢、共生、共同前行的战略伙伴，更矢志成为技术合作具有竞争力的企业，与您一起飞跃，共同成功!)