Rac kit-武汉纽斯特
1.刺激的和非刺激的细胞裂解液2.蛋白酶抑l制剂3.4°C管摇杆或摇床4.0.5MEDTA,pH8.05.1M氯化镁6.2倍还原SDS-PAGE样品缓冲液7.电泳和免l疫印迹系统8.免l疫印迹洗涤缓冲液,例如TBST(10mMTris-HCl,pH7.4,0.15MN***,0.05%吐温20)9.免l疫印迹封闭缓冲液(TBST包含5%脱脂奶粉或3%BSA)10.PVDF或硝l酸纤维素膜11.二抗12.ECL检测***武汉纽斯特生物科技有限公司(d),系美国生命科学***供应商美国NewEastBio在中国的子公司。美国NewEastBio专注于生命科学和生物技术领域,主要产品有小分子、ELISA***盒、蛋白等。悬浮细胞1.培养细胞并根据需要用活化剂或***l剂刺激。2.进行细胞计数,然后通过离心沉淀细胞。3.吸出培养基,并用冰冷的PBS洗涤两次。4.完全除去PBS洗涤液,Rackit,然后向细胞沉淀中加入冰冷的1X分析/裂解缓冲液(每1x107池0.5–1mL)。5.通过重复移液裂解细胞。6.将裂解物转移至适当大小的试管中,并置于冰上。7.如果发生核裂解,则细胞裂解液可能变得非常粘稠,难以移液。如果这发生时,裂解液可通过27?号***l器针头3-4次以剪切***组DNA。8.通过离心10分钟(在4°C下为12,000xg)清除裂解物。9.收集上清液并将样品保存在冰上以备立即使用,或速冻并保存在-70°C以备将来使用。阳性和阴性对照的体外GTPγS/GDP蛋白质上样量注意:体内刺激细胞会激l活大约10%的可用Rab35,而体外GTPγS蛋白负载将激l活近90%的Rab35。1.将0.5ml每种细胞提取物等分到两个微量离心管中(或使用1μg纯化的Rab35蛋白)。2.向每个试管中加入20μl0.5MEDTA(至20mM终浓度)。3.将5μl100XGTPγS(至100μM,终浓度)加到一个试管中(阳性对照)。4.在第二个试管中加入5μl100XGDP(至1mM,终浓度)(阴性对照)。5.在搅拌下将试管在30°C孵育30分钟。6.通过将试管放在冰上并添加32.5μl1MMgCl2(至60mM)。小G蛋白是从属于细胞调节因子中的一个超家族。Rho家族是小G蛋白中的一个亚家族,它在细胞运动、细胞分裂以及***转录中发挥主要作用。而本***盒中的Cd***2就属于Rho亚家族中的一种,Cd***2参与生理活动过程中其分子结构会呈现出2种相互转换的形式:与GTP结合的激l活状态和与GDP结合的非活性状态。目前Cd***2蛋白活性的检测主要是依据小GTP酶Cd***2可以与p21活化激酶(PAK)的p21结合区域(PBD)结合,使PAK活化从而发挥生物学功能,进而间接的进行Cd***2活性l功能的监测。然而此方法在检测过程中存在着一定的局限性比如GTP水解成GDP的速度过快以及Cd***2-GTP结合蛋白与p21结合区域之间较低的亲和力,导致这种检测方法的重复性较差。Rackit-武汉纽斯特由武汉纽斯特生物技术有限公司提供。武汉纽斯特生物技术有限公司在生***工这一领域倾注了诸多的热忱和热情,武汉纽斯特一直以客户为中心、为客户创造价值的理念、以品质、服务来赢得市场,衷心希望能与社会各界合作,共创成功,共创辉煌。相关业务欢迎垂询,联系人:黄经理。)
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