PCR技术的基本原理PCR技术是在模板DNA、引物和四种dNTP等存在的条件下.依赖于DNA聚合酶(Taq酶)的酶.促合成反应。其具体反应分三步:变性、退火、聚合。以上三步为一个循环，每一循环的产物DNA又可以作为下一个循环模板，数小时后，介于两个引物之间的目的DNA得到了大量的copy，经25~30次循环DNA数量可达2x1067拷贝数。锚定PCR(AnchoredPCR.APCR技术.用酶法在一通用引物反转录cDNA3-末端加上一段已知序列，然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增，称为APCR.应用:它可用于扩增未知或全知序列，PCR缓冲液，如未知cDNA的制备及低丰度cDNA文库的构建。出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个***组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有***或器材均应高压消毒。所用离心管及样进头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和***用紫外线照射，以***存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。PCR循环参数预变性模板DNA完全变性与PCR酶的完全激1活对PCR能否成功至关重要，建议加热时间参考***说明书，一般未修饰的Taq酶激1活时间为两分钟。变性步骤：循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性，可能的情况下可缩短该步骤时间。变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不，易造成扩增失败。引物退火：退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。退火温度对PCR的特异性有较大影响。引物延伸：引物延伸一般在72℃进行（Taq酶***适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kbp。循环数：大多数PCR含25-35循环，过多易产生非特异扩增。***后延伸在***后一个循环后，反应在72℃维持10-30分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。友名生物公司-PCR缓冲液由武汉友名生物技术有限公司提供。武汉友名生物技术有限公司是湖北武汉,其它的见证者，多年来，公司贯彻执行科学管理、创新发展、诚实守信的方针，满足客户需求。在友名生物***携全体员工热情欢迎各界人士垂询洽谈，共创友名生物更加美好的未来。)