内切酶-友名生物技术(图)
限制性内切酶对环状质粒DNA产生的酶切片段数与切口数一致。因此,鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数,就可以推断切口的数目;从片段迁移率可判断酶切片段大小。用已知分子量的线状DNA为对照,通过电泳迁移率的比较,可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子大小。质粒DNA的相对分子量(Mr)一般在106~107范围内,如质粒pBR的相对分子质量为2.8×106,在细胞内有三种构型:①共价闭环DNA,常以超螺旋形式存在;②如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,这种松弛型的分子叫作开环DNA;③双链线状DNA由于两条链的切口在同一部位被切断,不能成环,完全开放成线状,简称线性DNA。如果要测定质粒DNA的相对分子量,建议把质粒用单一切口的酶水解得到线性DNA部分片段。三种构型的质粒DNA在电泳时的泳动速度为:共价闭环DNA>线状DNA>开环DNA。根据限制酶的结构,辅因子的需求切位与作用方式,可将限制酶分为三种类型,分别是第yi型(TypeI)、第二型(TypeII)及第三型(TypeIII)。第yi型限制酶同时具有修饰(modification)及认知切割(restriction)的作用;另有认知(recognize)DNA上特定碱基序列的能力,通常其切割位(cle***agesite)距离认知位(recognition)可达数千个碱基之远。例如:EcoB、EcoK。第二型限制酶只具有认知切割的作用,修饰作用由其他酵素进行。所认知的位置多为短的回文序列(palindromesequence);所剪切的碱基序列通常即为所认知的序列。是遗传工程上,内切酶,实用性较高的限制酶种类。例如:EcoRI、HindIII。第三型限制酶与第yi型限制酶类似,同时具有修饰及认知切割的作用。可认知短的不对称序列,切割位与认知序列约距24-26个碱基对。例如:EcoPI、HinfIII。质粒载体和外源DNA中限制酶切位点的性质如今,质粒载体中限制酶切位点的种类极为繁多,因而通常都有可能找到某种带限制酶切位点恰恰与外源DNA部分片段本身毫无二致的载体。这就具备一个不可1比拟的优点,也应是可以用相应的限制酶消化重组质粒崦回收外源DNA。另一种方案,则是把片段插入到载体中能产生匹配末端的任何位点中。例如,识别不同的六核苷酸的限制酶BamHl和BglⅡ产生具有相同突出末端的限制酶切片段,这样用BglⅡ消化而制备的外源DNA部分片段可以克1隆到用BanHl消化的质粒中。这通常会使接合序列不能被曾用于外源DNA或制备载体的任何一种酶所切开。然而很多清况下,用切点位于多克1隆序列侧翼的限制酶进行消化,可将片段从重组质粒中摘出。偶尔在质粒的以及外源DNA两端的限制酶切位点之间,不可能找到“门当户对”的搭配关系。这时可用下面两种方案加以解决:1)在线状质粒末端和(或)外源DNA部分片段的末端接上合成在接头或衔接头。2)在得到控制的反应条件下,用大肠杆1菌DNA聚合酶IKlenow片段部分补平带3凹端的DNA部分片段。如第九章所讨论,这样常可以使那些不相匹配的限制酶切位点转变为互补末端,从而促进载体和外源DNA的连接。因为部分补平的反应消除了同一分子两端彼此配对的能力,故连接反应过程中环化和自身寡聚化的机会也会有所降低内切酶-友名生物技术(图)由武汉友名生物技术有限公司提供。武汉友名生物技术有限公司拥有很好的服务与产品,不断地受到新老用户及业内人士的肯定和信任。我们公司是商盟认证会员,点击页面的商盟***图标,可以直接与我们***人员对话,愿我们今后的合作愉快!)
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